從重組畢赤氏酵母中制備腺苷甲硫氨酸的研究.pdf

1、S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)是生物體的重要代謝中間物質(zhì),也是人體內(nèi)一種重要的生理活性物質(zhì),可作為一種重要的藥物.該實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建了強(qiáng)化表達(dá)腺苷甲硫氨酸合成酶的重組Pichia pastoris酵母,使其能強(qiáng)化積累SAM.在搖瓶發(fā)酵的基礎(chǔ)上,該文探討了中試發(fā)酵條件下,各重要發(fā)酵條件對(duì)其SAM產(chǎn)量的影響,建立了能高產(chǎn)SAM的中試發(fā)酵條件,并且研究摸索出了合適的分離SAM的下游工藝方法.通過(guò)5-L

2、工作體積發(fā)酵罐的發(fā)酵實(shí)驗(yàn),研究了發(fā)酵中pH、溶解氧、加甘油和甲硫氨酸等條件對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和SAM積累的影響.結(jié)果表明:重組菌在pH5.0時(shí)生長(zhǎng)比較旺盛,細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期后調(diào)節(jié)為pH6.0可以使重組Pichia pastoris繼續(xù)積累SAM.溶解氧低時(shí)SAM積累高于溶解氧高時(shí)SAM積累.優(yōu)化發(fā)酵初始甘油濃度為4％,并在發(fā)酵時(shí)流加甘油,有助于SAM的積累.前期加入一定量的甲硫氨酸,發(fā)酵中繼續(xù)流加補(bǔ)充,最后產(chǎn)量達(dá)到了4.3g/L.對(duì)發(fā)酵的菌體

3、,采用了先用乙酸乙脂處理,后用酸處理的破胞方法,離心后得到上清.選用不同的樹(shù)脂做靜態(tài)吸附及洗脫實(shí)驗(yàn),根據(jù)結(jié)果吸附及洗脫能力選用大孔弱酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂D151.用此樹(shù)脂裝柱來(lái)吸附SAM,根據(jù)試驗(yàn),確定了上清的上樣量,上清的最適pH,上樣的速度.采用分布洗脫的方法,先用水洗去雜質(zhì),然后用0.1mol/L的硫酸溶液洗脫得到含SAM的洗脫液.再經(jīng)過(guò)離子交換樹(shù)脂1×13.4脫鹽、濃縮后、用正丁醇和乙酸乙脂的混合液沉淀SAM,最后得到了SAM產(chǎn)品