無脊椎動物家蠶為材料的肝毒性模型實(shí)驗(yàn)動物替代研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)動物替代方法，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究領(lǐng)域。家蠶是鱗翅目模式昆蟲，有著數(shù)千年畜牧化養(yǎng)殖歷史，且已積累了系統(tǒng)深入的生理學(xué)、病理學(xué)和毒理學(xué)資料。家蠶遺傳突變資源的創(chuàng)新及其在基礎(chǔ)生命體系、物質(zhì)代謝、能量代謝和遺傳方式上與哺乳類有眾多相似性的發(fā)現(xiàn)，使家蠶作為中國特色的模式昆蟲正逐漸向?qū)嶒?yàn)動物模式化發(fā)展。然而，如何通過系統(tǒng)地控制實(shí)驗(yàn)用家蠶的遺傳因素和生長環(huán)境，實(shí)現(xiàn)家蠶“實(shí)驗(yàn)動物化”，如何根據(jù)家蠶的生物學(xué)特性，優(yōu)選出替代方法研究類型，是家蠶在成

2、為標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)動物過程中所必須突破的瓶頸。另外，家蠶與小鼠等經(jīng)典哺乳類模式動物相比，在外源化合物代謝動力學(xué)方面究竟存在哪些共性和差異，國內(nèi)外也尚無系統(tǒng)的研究。
　　本研究以家蠶實(shí)驗(yàn)動物化的標(biāo)準(zhǔn)建設(shè)為目的，總結(jié)了家蠶實(shí)驗(yàn)動物化的品種選育、飼養(yǎng)管理、設(shè)施管理等規(guī)范，設(shè)計了家蠶標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)微屏障系統(tǒng)；通過肝毒性模式藥物對乙酰氨基酚（APAP）處理，系統(tǒng)地比較研究家蠶與哺乳動物體內(nèi)APAP的急性毒性分級和藥代動力學(xué)特性；通過代謝組學(xué)方法、高通

3、量分析（RNA-Seq）方法調(diào)查APAP對家蠶內(nèi)源性代謝物和基因表達(dá)的差異，揭示APAP在體內(nèi)所產(chǎn)生的生物效應(yīng)；用試劑盒檢測APAP染毒后家蠶催化藥物代謝關(guān)鍵酶的活性，并通過生物信息學(xué)方法分析比較家蠶與小鼠等哺乳類在這些關(guān)鍵酶進(jìn)化上的差異及活性位點(diǎn)差異。研究獲得的主要結(jié)果如下：
　　1.模藥APAP對家蠶的急性毒性分級、藥代動力學(xué)特征能夠?yàn)獒t(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物替代建立平行數(shù)據(jù)
　　急性毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示，APAP對家蠶毒性因品種不同而

4、表現(xiàn)出毒性敏感性不同，大造較皓月敏感。APAP處理雌、雄大造品種的LD50分別為2017±254μg/g和2169±300μg/g。急性毒性分級為中低級毒性，與哺乳類相似。
　　代謝動力學(xué)結(jié)果表明，低濃度600μg/g劑量和高濃度3600μg/g劑量APAP在家蠶體內(nèi)的藥動學(xué)呈一室開放型模型，消除半衰期（t1/2）分別為1.06h和2.77h；原藥達(dá)峰時間（tmax）分別為0.50h和1.00h；原藥達(dá)峰值濃度（Cmax）分別為6

5、7.69μg/ml和568.73μg/ml。相對生物利用度（AUC0-t）分別為：222.63 h?μg/ml和1976.32 h?μg/ml。代謝中間產(chǎn)物有N-乙酰對苯醌亞胺（NAPQI）產(chǎn)生，與哺乳類相比，藥物吸收分布、體內(nèi)代謝中間產(chǎn)物、總體的動力學(xué)(PK)相似，能為醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物替代建立平行數(shù)據(jù)。
　　2.模藥APAP在家蠶的體內(nèi)能產(chǎn)生與哺乳類共同的生物效應(yīng)
　　代謝組學(xué)分析顯示，以600μg/g劑量APAP經(jīng)口給藥家蠶

6、8 h后，循環(huán)血中差異代謝物在三羧酸循環(huán)、糖酵解途徑、氨基酸代謝、黑色素生成等途徑中，說明APAP在體內(nèi)所產(chǎn)生的毒性途徑主是因?yàn)樗幬锎x過程中產(chǎn)生了氧化應(yīng)激，影響了體內(nèi)能量供給、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和信號傳導(dǎo)。代謝物差異分析發(fā)現(xiàn)，APAP誘導(dǎo)家蠶血淋巴中氨基酸代謝產(chǎn)生差異，推測氨基酸代謝的異常和蘋果酸、琥珀酸、延胡索酸等內(nèi)源代謝物的顯著下降相關(guān)，也與APAP染毒后產(chǎn)生的氧化應(yīng)激相關(guān)。酪氨酸、多巴、海藻糖的顯著升高進(jìn)一步證實(shí)過量的APAP導(dǎo)致了氧化應(yīng)

7、激的產(chǎn)生；APAP誘導(dǎo)家蠶的膽固醇降低，卻使β-羥基β-甲基戊二酸升高，表明APAP導(dǎo)致家蠶的膽固醇合成途徑失衡，甾體激素的原料供給障礙影響機(jī)體的激素調(diào)節(jié)。
　　3.模藥APAP在家蠶的體內(nèi)能產(chǎn)生與哺乳類共同的藥理作用和毒性機(jī)理
　　RNA-Seq結(jié)果分析APAP給藥實(shí)驗(yàn)組與對照組的差異基因表達(dá)顯示，在KEGG分析系統(tǒng)中與新陳代謝相關(guān)的通路里，大量的差異表達(dá)基因富集于三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化、脂肪酸的氧化、糖酵解和糖異生等高產(chǎn)

8、能環(huán)節(jié)，從基因表達(dá)水平上進(jìn)一步證明，APAP對家蠶機(jī)體的傷害，主要是氧化應(yīng)激和能量代謝、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、信號傳導(dǎo)等途徑異常所至，這與哺乳類所產(chǎn)生的肝損傷機(jī)理一致。
　　在KEGG分析系統(tǒng)中與有機(jī)體系統(tǒng)相關(guān)的通路里，大量的差異表達(dá)基因富集于心臟肌肉收縮、血管平滑肌收縮和調(diào)節(jié)肌動蛋白骨架等循環(huán)系統(tǒng)的相關(guān)通路，以及部分神經(jīng)元突觸基因通路，這些與代謝組學(xué)結(jié)果一致。推測APAP對家蠶具有與哺乳類相一致的抑制花生四烯酸通路的藥理作用。
　　4

9、.家蠶與小鼠的藥物代謝關(guān)鍵酶具有共同的活性位點(diǎn)和蛋白質(zhì)互作機(jī)制
　　生物信息分析結(jié)果顯示，家蠶和小鼠的谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶家族成員（GSTs）在結(jié)構(gòu)域和功能域方面，大多具有GSTs活性區(qū)域以及硫氧還蛋白的折疊模式；家蠶和小鼠的谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLc)蛋白都具有谷胱甘肽合成酶的功能域，谷氨酸半胱氨酸連接酶(GCLM）都具有NADP依賴氧化還原酶功能域；家蠶硫氧還蛋白過氧化物酶家族（TPXs）中Jafrac1基因編碼的過氧化

10、物酶蛋白與小鼠的Prdx1和Prdx2基因編碼的過氧化物酶具有高度保守的結(jié)構(gòu)，家蠶的預(yù)測蛋白LOC733003、LOC101735759、LOC732921分別具有小鼠的Prdx3、Prdx4、Prdx5編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；家蠶的2個葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶成員（UGTs）和小鼠的21個UGTs成員具有共同的尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸和尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶保守功能域；家蠶和小鼠的細(xì)胞色素P450酶（CYP450）家族成員也具有CYP450

11、保守的結(jié)構(gòu)域和功能域。家蠶和小鼠的藥物代謝關(guān)鍵酶的結(jié)構(gòu)與功能域上的保守性，提示兩者在主要的解毒過程與作用機(jī)理中可能存在共同的特點(diǎn)。
　　5.家蠶中腸是可建立肝毒性模型的經(jīng)口給藥“首關(guān)效應(yīng)”器官
　　根據(jù)APAP經(jīng)口經(jīng)藥家蠶組織中原藥APAP、中間產(chǎn)物NAPQI分布特點(diǎn)，催化藥物代謝反應(yīng)的關(guān)鍵酶(GST、GCL、TPX、UGT、CYP450等)的活性變化結(jié)果可知，中間產(chǎn)物經(jīng)中腸后產(chǎn)量明顯提高，高劑量APAP可造成中腸的吸收功能

12、障礙。中腸組織中CYP450酶活變化顯著，中腸組織中GST、GCL、TPX、UGT酶活本底顯著高于脂肪體，且相應(yīng)代謝酶活性變化較為顯著。表明在經(jīng)口給藥途徑中，家蠶中腸是藥物代謝的“首關(guān)效應(yīng)”器官。在經(jīng)口給藥途徑中，家蠶的中腸與脂肪體相比而言，作為外源藥物的“首關(guān)效應(yīng)”器官，類比哺乳類解毒器官（肝臟）更為準(zhǔn)確。家蠶中腸是更合適的研究哺乳類肝毒性藥物毒性機(jī)理的靶器官（組織）模型。
　　6.結(jié)論
　　家蠶已具備實(shí)驗(yàn)動物化的基本條件