Calpeptin拮抗丙烯酰胺中毒大鼠神經(jīng)絲磷酸化相關(guān)激酶的機(jī)制.pdf

1、目的:
　　丙烯酰胺(acrylamide/acrylic amide，ACR)是一種水溶性的、乙烯基白色晶體，應(yīng)用廣泛。研究表明，ACR引起以共濟(jì)失調(diào)、骨骼肌無(wú)力、震顫為主的周圍神經(jīng)退行性變。蛋白激酶A(Protein KinaseA，PKA)、蛋白激酶C(Protein KinaseC，PKC)、周期素依賴性蛋白激酶5(Cyclin-dependent kinase5，Cdk5)可磷酸化富含絲氨酸/蘇氨酸的神經(jīng)絲(neurof

2、ilament，NFs)蛋白，使NFs結(jié)構(gòu)功能發(fā)生改變，影響細(xì)胞骨架形成。鈣蛋白水解酶(calpain)依賴Ca2+激活，可改變PKA、PKC、Cdk5等含量。我們推測(cè)，ACR可能通過(guò)Ca活化calpain，以激活PKA、PKC、Cdk5，改變NFs磷酸化狀態(tài)，最終致ACR神經(jīng)病。本實(shí)驗(yàn)建立大鼠ACR亞慢性中毒模型及鈣蛋白酶抑制劑calpeptin(CP)干預(yù)模型，觀察神經(jīng)行為學(xué)及病理形態(tài)，檢測(cè)Ca2+濃度、PKA、PKC、Cdk5含量

3、，探討CP拮抗丙烯酰胺中毒大鼠神經(jīng)絲磷酸化相關(guān)激酶的機(jī)制。
　　方法:
　　1.模型建立:成年雌性60只Wistar大鼠隨機(jī)分為四組，即空白對(duì)照組、CP對(duì)照組、ACR模型組、ACR+CP干預(yù)組。ACR模型組和ACR+CP干預(yù)組按30mg/kg·bw腹腔注射ACR染毒3次/周，空白對(duì)照組給予等體積生理鹽水;CP對(duì)照組與ACR+CP干預(yù)組給予200ug/kg· bw CP，6次/周，連續(xù)四周。染毒終止，分離脊髓與坐骨神經(jīng)備用。染

4、毒期間每周進(jìn)行體重稱量、步態(tài)評(píng)分和后肢抓力的測(cè)定。
　　2.鈣離子:分離脊髓，鈣離子熒光探針(Fura-2/AM)負(fù)載法測(cè)定鈣離子濃度。
　　3.蛋白含量:使用SDS-PAGE凝膠電泳和Western blot法對(duì)脊髓和坐骨神經(jīng)組織中PKA、PKC、Cdk5含量分析。
　　4.NFs磷酸化:常規(guī)免疫組化法（SP法），觀察脊髓與坐骨神經(jīng)內(nèi)NFs磷酸化水平。
　　5.形態(tài)學(xué):HE和甲苯胺藍(lán)染色觀察脊髓與坐骨神經(jīng)病理形

5、態(tài);透射電鏡觀察坐骨神經(jīng)組織內(nèi)有髓神經(jīng)纖維以及g-Ratio變化。
　　結(jié)果:
　　1.體重
　　自染毒第二周起，與空白對(duì)照組相比，CP對(duì)照組無(wú)明顯差異（P＞0.05），ACR模型組同期體重明顯低于空白對(duì)照組(P＜0.05);與ACR模型組相比，ACR+CP干預(yù)組同期體重明顯高于ACR模型組(P＜0.05)。
　　2.神經(jīng)行為學(xué)
　　(1)步態(tài)評(píng)分:自染毒第二周起，與空白對(duì)照組比，CP對(duì)照組無(wú)明顯差異(P＞

6、0.05)，ACR模型組得分同期明顯升高（P＜0.05）;與ACR模型組比，ACR+CP干預(yù)組同期得分明顯降低(P＜0.05)。
　　(2)后肢抓力:自染毒第二周起，與空白對(duì)照組比，CP對(duì)照組無(wú)明顯差異(P＞0.05)，ACR模型組同期抓力明顯降低(P＜0.05);與ACR模型組比，ACR+CP干預(yù)組同期抓力明顯升高(P＜0.05)。
　　3.脊髓Ca2+含量
　　與空白對(duì)照組比，CP對(duì)照組的Ca2+濃度無(wú)顯著變化(P

7、＞0.05)，ACR模型組的Ca2+濃度顯著升高（P＜0.05）;與ACR組比，ACR+CP干預(yù)組的Ca2+濃度顯著降低(P＜0.05)。
　　4.NFs磷酸化相關(guān)激酶
　　與空白對(duì)照組比，ACR模型組脊髓組織中PKA含量略有降低(P＞0.05)，PKC含量顯著升高(P＜0.05)，坐骨神經(jīng)組織中PKA、PKC和Cdk5含量均顯著升高(P＜0.05);與ACR模型組比，ACR+CP干預(yù)組脊髓組織中PKA明顯升高(P＜0.05

8、)，PKC含量顯著下降(P＜0.05)，坐骨神經(jīng)組織中PKA、PKC和Cdk5含量均顯著下降(P＜0.05)。
　　5.脊髓及坐骨神經(jīng)NFs磷酸化
　　ACR模型組大鼠磷酸化的NFs較空白對(duì)照組染色深，而ACR+CP干預(yù)組大鼠染色較ACR模型組染色淺;ACR模型組非磷酸化的NFs較空白對(duì)照組染色淺;ACR+CP干預(yù)組較ACR模型組染色深。
　　6.組織形態(tài)學(xué)
　　(1)脊髓:與空白對(duì)照組比，ACR模型組運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元

9、減少，核固縮、核膜核仁溶解或消失，尼氏體分布降低;與ACR模型組比，ACR+CP干預(yù)組運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元較正常、數(shù)量略有增加，尼氏體增加。
　　(2)坐骨神經(jīng):與空白對(duì)照組比，ACR模型組的坐骨神經(jīng)截面破損，細(xì)胞稀松，髓鞘排列松散，髓鞘板層斷裂和/或向內(nèi)擠壓軸漿，g-Ratio顯著下降(P＜0.05);與ACR模型組相比，ACR+CP干預(yù)組髓鞘損傷得到緩解，g-Ratio顯著上升（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.CP能夠