三氧化二砷對肺癌新生血管生成的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率最高、致死數(shù)最多的惡性腫瘤，肺癌的治療是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域所關(guān)注的重要內(nèi)容之一。三氧化二砷(arsenic trioxide，As2O3)在肺癌治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　　本研究首先擬通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)確定As2O3對不同病理類型肺癌移植瘤的生長及肺癌新生血管的抑制作用，以及對移植瘤組織VEGF和Dll4-Notch通路相關(guān)因子表達(dá)的影響;然后通過一系列體外實(shí)驗(yàn)，觀察As2O3對肺癌血管新生過程多階段（

2、內(nèi)皮細(xì)胞增殖、內(nèi)皮細(xì)胞遷移、管腔結(jié)構(gòu)形成）的影響;最后，以內(nèi)皮細(xì)胞為研究對象，研究Dll4-Notch介導(dǎo)As2O3抑制血管管腔形成的作用機(jī)制，并檢測臨床患者肺癌組織中Dll4-Notch通路相關(guān)因子的表達(dá)情況。希望通過本研究，為As2O3抑制肺癌的作用提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)，對As2O3的肺癌新生血管調(diào)控機(jī)制做出進(jìn)一步論證，并探討As2O3在肺癌治療中的應(yīng)用前景。
　　方法：
　　第一部分 三氧化二砷對肺癌移植瘤生長及新生血管的抑制

3、作用
　　分別利用人肺腺癌細(xì)胞系、人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞系以及人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系構(gòu)建肺癌皮下移植瘤裸鼠模型;鏡下觀察各移植瘤組織是否符合腺癌、大細(xì)胞癌和小細(xì)胞癌的病理特征。造模成功后用2.5mg/kg和5.0mg/kg的As2O3進(jìn)行干預(yù)，以血管靶向抑制劑索拉非尼作為對照藥物，以生理鹽水作為空白對照，比較各組腫瘤體積和腫瘤生長抑制率;利用CD31熒光抗體對移植瘤組織切片進(jìn)行染色，比較各組腫瘤組織中新生血管的數(shù)量及形態(tài);利用電鏡觀察As2

4、O3對移植瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響。利用免疫熒光、Western Blot和定量PCR等方法，檢測各組移植瘤中VEGF-A、VEGFR-2、HIF-1α、Dll4和Notch-1等因子在蛋白水平或mRNA水平的表達(dá)情況。
　　第二部分 三氧化二砷對肺癌新生血管生成過程多階段的抑制作用:抑制內(nèi)皮增殖、遷移和管腔形成
　　分別用不同濃度的As2O3處理NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、SCLC細(xì)胞系NCI-H446和人臍靜脈內(nèi)皮

5、細(xì)胞（HUVECs），以血管抑制劑索拉非尼作為對照藥物，以生理鹽水作為空白對照。利用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的增殖情況;通過細(xì)胞劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測各組HUVECs的遷移能力;通過Matrigel體外成管實(shí)驗(yàn)觀察各組HUVECs形成血管網(wǎng)絡(luò)的能力。利用Western blot和定量PCR，觀察血管生成各階段（內(nèi)皮遷移、增殖及成管）所涉及的促血管因子及其受體在各組細(xì)胞中的表達(dá)情況，包括MMP-2、MMP-9、PDGF-BB/PDGFR-β、

6、VEGF-A/VEGFR-2、bFGF/FGFR-1和Dll4/Notch-1。
　　第三部分 Dll4-Notch介導(dǎo)三氧化二砷抑制內(nèi)皮細(xì)胞成管的作用機(jī)制研究
　　首先，構(gòu)建Dll4過表達(dá)慢病毒和Notch-1干擾慢病毒，并利用這兩種慢病毒及相應(yīng)的陰性對照慢病毒感染HUVECs細(xì)胞，再以As2O3進(jìn)行干預(yù)，以生理鹽水作為空白對照，觀察各組內(nèi)皮細(xì)胞在Matrigel上的管腔形成能力，并檢測各組細(xì)胞Dll4、Notch-1及其

7、下游靶基因Hes-1的表達(dá)水平。最后，利用免疫組化方法檢測臨床肺癌患者手術(shù)標(biāo)本腫瘤組織與癌旁組織中Dll4-Notch通路和VEGF通路相關(guān)因子的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　第一部分 三氧化二砷對肺癌移植瘤生長及新生血管的抑制作用
　　1、As2O3能抑制裸鼠肺腺癌、大細(xì)胞癌、小細(xì)胞癌皮下移植瘤的生長，且呈劑量依賴性。干預(yù)結(jié)束時(shí)，As2O3處理組和索拉非尼組的腫瘤平均體積均小于生理鹽水組。肺腺癌模型中，As2O32.5

8、mg/kg組、As2O35.0mg/kg組和索拉非尼組的腫瘤生長抑制率(TGI)分別是28.8％、42.4％和64.9％;肺大細(xì)胞癌模型中，3組的TGI分別是71.1％、84.9％和87.2％;肺小細(xì)胞癌模型中，3組的TGI分別是27.7％、56.8％和49.1％。
　　2、對移植瘤組織切片用CD31抗體進(jìn)行免疫熒光染色以顯示血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示:三種病理類型的肺癌移植瘤中，As2O3處理組的新生血管密度較對照組明顯減少，且血管

9、的管腔結(jié)構(gòu)少于對照組。
　　3、在肺癌細(xì)胞和Matrigel混合移植模型中，剝離抑制體觀察大體可見，對照組的Matrigel內(nèi)血管豐富，而隨著As2O3劑量增加，Matrigel內(nèi)血管逐漸匱乏。Masson染色可見位于毛細(xì)血管中的紅細(xì)胞，結(jié)果顯示:對照組的血液充盈毛細(xì)血管最多，隨著As2O3劑量的增加，血液充盈毛細(xì)血管依次減少。用CD31熒光抗體染色以顯示內(nèi)皮細(xì)胞，結(jié)果顯示:As2O3處理組的新生血管密度較對照組明顯減少，且管腔結(jié)

10、構(gòu)較對照組明顯異常，管腔呈現(xiàn)扭曲、閉鎖的現(xiàn)象。
　　4、電鏡下觀察肺癌移植瘤組織新生血管內(nèi)皮超微結(jié)構(gòu)，對照組的血管內(nèi)皮細(xì)胞胞膜光滑完整，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰，而As2O3處理組的內(nèi)皮細(xì)胞胞膜發(fā)生皺縮，核仁在核膜下發(fā)生聚集，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的空泡樣變增多。
　　5、定量PCR、Western blot和免疫熒光檢測結(jié)果提示，As2O3處理組移植瘤組織中VEGF-A、VEGFR-2、HIF-1α、Dll4和Notch-1的表達(dá)水平均低于對照組

11、。
　　第二部分 三氧化二砷對肺癌新生血管生成過程多階段的抑制作用:抑制內(nèi)皮增殖、遷移和管腔形成
　　1、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，As2O3處理NSCLC及SCLC細(xì)胞，24h后As2O3處理組與對照組的肺癌細(xì)胞增殖情況未見顯著差異;處理48h后，As2O3處理組的肺癌細(xì)胞增殖略低于對照組。而另一方面，As2O3對內(nèi)皮細(xì)胞的增殖抑制在24h時(shí)就非常顯著，到48h抑制增殖更加明顯，4μMAs2O3與血管抑制劑索拉非尼對內(nèi)皮細(xì)胞的

12、增殖抑制作用相當(dāng)。
　　2、HUVECs細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，劃痕后24h可以觀察到As2O3處理組的劃痕修復(fù)能力比其他各組減弱。至劃痕后48h，As2O3處理組的細(xì)胞遷移距離顯著低于生理鹽水對照組，As2O34μM組比2μM組更加明顯，而索拉非尼組的細(xì)胞遷移距離卻與生理鹽水組沒有顯著差異。
　　3、Matrigel體外成管實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，As2O3能顯著減少HUVECs的細(xì)胞連線數(shù)量，并能破壞管腔結(jié)構(gòu)形成，使其連線中斷、不能

13、形成網(wǎng)絡(luò)構(gòu)造;索拉非尼也能減少細(xì)胞連線數(shù)量，但每個(gè)管腔結(jié)構(gòu)依然完整，管腔形態(tài)與對照組相似。
　　4、As2O3呈劑量依賴性下調(diào)肺癌細(xì)胞VEGF-A、bFGF、MMP-2、MMP-9和PDGF-BB的蛋白水平，并呈劑量依賴性下調(diào)HUVECs中VEGFR-2、FGFR-1、MMP-2、MMP-9和PDGFR-β的蛋白水平。同時(shí)，As2O3能劑量依賴性下調(diào)肺癌細(xì)胞中VEGF-A的上游因子HIF-1α的mRNA表達(dá)水平。As2O3能在蛋白

14、水平抑制肺癌細(xì)胞Dll4與HUVECs細(xì)胞Notch-1的表達(dá)。
　　第三部分 Dll4-Notch介導(dǎo)三氧化二砷抑制內(nèi)皮細(xì)胞成管的作用機(jī)制研究
　　1、成功構(gòu)建Dll4過表達(dá)慢病毒和Notch-1干擾慢病毒，并用其感染HUVECs細(xì)胞。結(jié)果顯示Dll4過表達(dá)慢病毒感染可上調(diào)HUVECs的Dll4表達(dá)，Notch-1干擾慢病毒感染可下調(diào)HUVECs的Notch-1表達(dá)。
　　2、Matrigel體外成管實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:陰

15、性對照慢病毒感染的HUVECs在未加As2O3時(shí)能形成交聯(lián)的血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，添加As2O3時(shí)則不能形成完整的管腔結(jié)構(gòu);過表達(dá)Dll4后，未加As2O3時(shí)能形成交聯(lián)的血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，添加As2O3時(shí)則不能形成完整的管腔結(jié)構(gòu)，僅能形成個(gè)別條索狀結(jié)構(gòu);而抑制Notch-1后，在未添加As2O3時(shí)則已經(jīng)不能形成管腔結(jié)構(gòu)，添加As2O3時(shí)甚至連個(gè)別的條索狀結(jié)構(gòu)也不會出現(xiàn)。
　　3、Western blot檢測各組HUVECs細(xì)胞Dll4-Not

16、ch通路及其下游分子在蛋白水平的表達(dá)情況，在陰性對照慢病毒感染的HUVECs細(xì)胞中，As2O3對Dll4表達(dá)的影響不明顯，但能夠明顯抑制Notch-1及其下游靶基因Hes-1的表達(dá);在Dll4過表達(dá)的HUVECs細(xì)胞中，As2O3依然能夠下調(diào)Notch-1和Hes-1的表達(dá);在Notch-1mRNA干擾的HUVECs細(xì)胞中，Notch-1和Hes-1表達(dá)本身就被下調(diào)，As2O3的添加起到疊加作用，使Notch-1和Hes-1的下調(diào)程度更

17、大。
　　4、對我們收集的肺癌臨床標(biāo)本進(jìn)行免疫組化檢測，結(jié)果顯示:Dll4、Notch-1、Hes-1和VEGFR-2在肺癌組織中的表達(dá)量均高于癌旁組織。
　　結(jié)論：
　　1、As2O3能通能過抗血管作用從而抑制肺癌移植瘤生長。As2O3不僅可以減少肺癌移植瘤中的新生血管數(shù)量，還能阻礙其管腔結(jié)構(gòu)的形成、破壞肺癌新生血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，這可能與其下調(diào)VEGF通路及Dll4-Notch通路的作用有關(guān)。
　　2、As

18、2O3能抑制肺癌新生血管生成過程中的多個(gè)階段，包括細(xì)胞外基質(zhì)的降解、內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和管腔形成，并抑制上述各階段所涉及多個(gè)促血管因子的表達(dá)。
　　3、As2O3通過抑制Notch-1從而阻斷Dll4-Notch信號通路及其下游因子，抑制內(nèi)皮細(xì)胞形成血管管腔的能力。
　　4、Dll4-Notch通路相關(guān)因子（包括Dll4、Notch-1和Hes-1等）在患者肺癌組織中高表達(dá)，提示該通路可能是As2O3在人體內(nèi)抑制肺癌的作用靶