出生后大鼠卵巢中卵子再生的研究.pdf

1、近來(lái)有研究報(bào)道說(shuō)明出生后的幼年和成年小鼠卵巢表面上皮(OSE)有生殖干細(xì)胞(GSCs)和卵泡更新過(guò)程。這些報(bào)道引發(fā)了許多質(zhì)疑和爭(zhēng)論。本文對(duì)大鼠卵巢進(jìn)行了類似研究，以檢查大鼠卵巢內(nèi)是否也具有GSCs和卵泡更新過(guò)程。主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　 本文選擇大鼠的vasa類似物RVLGN端的部分片段作為抗原制備抗體識(shí)別大鼠卵巢中的生殖細(xì)胞。首先克隆了RVLG基因的cDNA5’端約627 bp片段，序列測(cè)定結(jié)果表明，我們所克隆的RVLG cD

2、NA片段比GenBank中報(bào)道的大鼠RVLG cDNA(NM_001077647)相應(yīng)部位多60 bp。與大鼠RVLG基因序列(NW_001084795.1)比對(duì)后確定所多出來(lái)的60 bp系第7內(nèi)含子的5’端和第8內(nèi)含子的3’端兩處選擇性剪接的結(jié)果，導(dǎo)致第7外顯子3’端多出45 bp，第9外顯子5’端多出15 bp。進(jìn)一步克隆RVLG cDNA全長(zhǎng)序列后發(fā)現(xiàn)第一次克隆中出現(xiàn)的60 bp只保留了第7外顯子3’端的45 bp，而沒(méi)有第9外顯

3、子5’端的15 bp。將該片段插入原核表達(dá)載體pGEX-4T1，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中成功地誘導(dǎo)表達(dá)了GST-pRVLG融合蛋白，目的蛋白占菌體總蛋白的10%以上。用純化后的GST-pRVLG融合蛋白免疫昆明(KM)小鼠，最后給小鼠腹腔注射S180細(xì)胞制備了抗RVLG的腹水多克隆抗體。Westernblot鑒定RVLG腹水多克隆抗體的特異性表明制備的抗體可特異性地識(shí)別RVLG蛋白。
　　 本文研究了幼年和成年期大鼠卵巢

4、表面是否存在可以維持新生卵子發(fā)生的GSCs，以及新生卵子發(fā)生所需的一些減數(shù)分裂標(biāo)記基因的表達(dá)情況。卵巢組織切片觀察表面上皮沒(méi)有找到大的卵圓形細(xì)胞，免疫組織化學(xué)檢查卵巢皮層也沒(méi)有找到RVLG陽(yáng)性細(xì)胞及RVLG、BrdU雙陽(yáng)性細(xì)胞。RT-PCR檢測(cè)出生后大鼠卵巢，也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)減數(shù)分裂特異性基因Scp1、Scp3和Spo11的轉(zhuǎn)錄。Westernblot和免疫組織化學(xué)法均未能檢測(cè)到減數(shù)分裂進(jìn)入標(biāo)記DMC1、STRA8及SCP3。實(shí)驗(yàn)未能觀察到成