改善泛素系統(tǒng)提高植物逆境適應(yīng)性研究.pdf

1、植物生長發(fā)育的許多過程都是由短命調(diào)節(jié)蛋白的選擇性降解控制的。其中泛素/26S蛋白酶體降解途徑是植物體生命過程最精細(xì)的調(diào)節(jié)機制之一。2004年諾貝爾化學(xué)獎桂冠由以色列科學(xué)家阿龍·切哈諾沃、阿夫拉姆·赫什科和美國科學(xué)家歐文·羅斯共同分享，就是因為他們在泛素(ubiquitin)調(diào)控蛋白質(zhì)降解機制的研究中做出了杰出的貢獻(xiàn)。在泛素途徑中，泛素用來標(biāo)記需要降解的蛋白質(zhì)，被標(biāo)記的靶蛋白繼而被26S蛋白酶體識別并降解掉。研究表明“無功能的蛋白質(zhì)在細(xì)胞

2、內(nèi)積累”是逆境脅迫對生物細(xì)胞產(chǎn)生傷害的共同特性，及時處理這些“垃圾”蛋白成為生物適應(yīng)逆境的重要方式。快速生長及逆境條件下泛素基因的表達(dá)明顯增加，泛素/26S蛋白酶體途徑降解短命調(diào)節(jié)蛋白及異常蛋白質(zhì)的速度也明顯增加?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)泛素普遍存在于所有真核生物中，但過量表達(dá)泛素基因在提高植物逆境適應(yīng)性方面的工作還鮮見報道。 本論文在克隆了小麥泛素基因的基礎(chǔ)上，研究了小麥泛素基因表達(dá)對水分脅迫的反應(yīng)；構(gòu)建了泛素基因的正義和反義表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化煙

3、草獲得了過量表達(dá)泛素基因和反義抑制泛素基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草植株；對轉(zhuǎn)基因植株的逆境適應(yīng)能力進行了鑒定分析。研究發(fā)現(xiàn)小麥泛素基因Ta-Ub1和Ta-Ub2的表達(dá)均受到水分脅迫的調(diào)控；過量表達(dá)泛素基因提高了轉(zhuǎn)基因植株的抗逆性；抑制泛素基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株葉片出現(xiàn)程序化死亡表型，抗逆性減弱。主要結(jié)果如下： 1、小麥泛素基因Ta-Ub1(注冊號：AY862401)在水分脅迫條件下上調(diào)表達(dá)，用20％和30％PEG-6000模擬水分脅迫條件

4、，發(fā)現(xiàn)隨著水分脅迫的加劇表達(dá)量逐漸增加，30％PEG處理的小麥幼苗中基因表達(dá)量高于20％PEG處理。 2、小麥泛素基因Ta-Ub2(注冊號：AY297059)的表達(dá)同樣對水分脅迫產(chǎn)生響應(yīng)，中度水分脅迫(20％PEG-6000處理)誘導(dǎo)Ta-Ub2基因上調(diào)表達(dá)，但嚴(yán)重水分脅迫條件下(30％PEG處理)該基因的表達(dá)下降，甚至低于正常供水對照。 3、構(gòu)建了小麥泛素基因Ta-Ub2正義表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化煙草，半定量RT-PCR檢測證

5、明獲得了過量表達(dá)小麥泛素基因的轉(zhuǎn)基因煙草植株，且不同轉(zhuǎn)基因系表達(dá)轉(zhuǎn)基因mRNA的水平有差異；同時，克隆了煙草泛素基因Ta-Ub1(注冊號：DQ830978)，構(gòu)建反義表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化煙草，經(jīng)半定量RT-PCR檢測，獲得了不同表達(dá)水平的反義轉(zhuǎn)化煙草植株。 4、購買商業(yè)泛素蛋白抗體，免疫法檢測正義和反義轉(zhuǎn)基因煙草葉片中泛素蛋白豐度，結(jié)果表明無論是過量表達(dá)Ta-Ub2泛素基因(編碼一個單體泛素)還是反義抑制泛素基因表達(dá)，均未對轉(zhuǎn)基因植株

6、體內(nèi)泛素蛋白豐度產(chǎn)生明顯影響，但轉(zhuǎn)基因植株抗逆性檢測表明，目的基因?qū)D(zhuǎn)基因植株生長發(fā)育所產(chǎn)生的生物學(xué)響應(yīng)卻非常明顯。表現(xiàn)在以下幾個方面： (1)正常生長條件下，過量表達(dá)小麥Ta-Ub2泛素基因的轉(zhuǎn)基因植株就比對照呈現(xiàn)更好的長勢。 (2)過量表達(dá)小麥Ta-Ub2泛素基因提高了轉(zhuǎn)基因煙草抗旱、抗鹽及抵抗低溫脅迫的能力，表現(xiàn)在種子萌發(fā)加快、幼苗生長勢加強、水分保持及光合能力加強等，對多種逆境的適應(yīng)能力均提高；同時，過量表達(dá)小麥

7、Ta-Ub2泛素基因還提高了轉(zhuǎn)基因煙草抵抗綜合逆境脅迫(如低溫與干旱并存、低溫與鹽脅迫并存)的能力。 (3)反義抑制煙草泛素基因表達(dá)使轉(zhuǎn)基因植株葉片出現(xiàn)早衰、黃化、色素含量降低，出現(xiàn)壞死斑點等癥狀；同時，反義轉(zhuǎn)基因植株抗旱及抗鹽脅迫的能力降低，表現(xiàn)在逆境條件下幼苗萌發(fā)與生長勢弱，葉片光合能力與水分保持能力減弱等。 5、對正、反義轉(zhuǎn)泛素基因煙草植株體內(nèi)超氧陰離子自由基積累狀況進行檢測，發(fā)現(xiàn)反義抑制泛素基因表達(dá)使轉(zhuǎn)基因植株體

8、內(nèi)積累的超氧陰離子比對照植株多，而過量表達(dá)泛素基因的轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)積累的超氧陰離子積累較少。推測活性氧自由基積累量不同可能是不同轉(zhuǎn)基因植株抗逆性差異的原因之一，泛素途徑與活性氧清除有關(guān)。 植物在田間環(huán)境中所遭遇的往往不只是單一的逆境脅迫，而是幾種逆境同時出現(xiàn)(即綜合逆境)共同作用于植物，這種情況往往對植物造成致死性傷害。植物對多種脅迫同時存在的反應(yīng)方式與對單一逆境脅迫之間既存在差異，又具有相同之處。提高植物對多種逆境的適應(yīng)能力，