同種異體組織工程化軟骨局部免疫豁免誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、為了構(gòu)建局部免疫耐受的同種異體組織工程化軟骨，延長(zhǎng)其在體內(nèi)存活時(shí)間．我們首先應(yīng)用RT-PCR和TA克隆技術(shù)從激活的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增mFasL cDNA并克隆到T載體，并經(jīng)測(cè)序確證。為了探討逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)染同種異體軟骨細(xì)胞的最佳條件，本研究利用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP）具有表達(dá)熒光特異性高、易于檢測(cè)等獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，構(gòu)建能穩(wěn)定表達(dá)EGFP的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體EGFP－PLNCX2，轉(zhuǎn)染同種異體軟骨細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染

2、的效果，流式細(xì)胞儀測(cè)定轉(zhuǎn)染的效率。為了觀察逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)介導(dǎo)體軟骨細(xì)胞后是否影響軟骨的構(gòu)建，利用以上EGFP重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染的的軟骨細(xì)胞和組織工程材料 pluronic-27復(fù)合物構(gòu)建兔同種異體組織工程軟骨 ，熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察其構(gòu)建過(guò)程和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)介導(dǎo)基因的體內(nèi)表達(dá)格局；在掌握逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)介導(dǎo)基因的體外和體內(nèi)規(guī)律后，構(gòu)建目的基因FasL（CD178）的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)，RT-PCR、免疫印跡、免

3、疫組織化學(xué)、流式細(xì)胞儀和生物學(xué)活性等多種水平證實(shí)mFasL（CD178）蛋白在該系統(tǒng)的表達(dá)，最后利用FasL（CD178）重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染的軟骨細(xì)胞和組織工程材料 pluronic F-127復(fù)合物構(gòu)建兔同種異體組織工程軟骨，與未轉(zhuǎn)染者比較其在體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸。結(jié)果顯示：重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體EGFP-PLNCX2能有效地轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染的軟骨細(xì)胞能形成組織工程軟骨，增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）是組織工程化軟骨形成過(guò)程