TIF1γ介導(dǎo)丙戊酸鈉抑制前列腺癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景
　　前列腺癌是全球范圍內(nèi)男性第二大惡性腫瘤，我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率近十年來(lái)逐年增長(zhǎng)。在我國(guó)，超過(guò)40％的前列腺癌患者確診時(shí)已經(jīng)進(jìn)入中晚期，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于歐美水平。雄激素剝奪治療(Androgen deprivation therapy，ADT)是國(guó)內(nèi)外晚期前列腺癌的主要治療方式，但其有效期一般僅能維持18-24個(gè)月。在ADT治療失效之后，疾病將發(fā)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌(Castrateresistant prostate can

2、cer，CRPC)，部分患者的腫瘤甚至進(jìn)一步轉(zhuǎn)移至前列腺以外的其它器官。針對(duì)轉(zhuǎn)移性去勢(shì)抵抗性前列腺癌雖然可以選擇新型雄激素生物合成酶抑制劑治療，但作用有限。因此，尋求更多更有效的治療方法是目前研究的方向。
　　上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到重要的調(diào)控作用，在腫瘤細(xì)胞的EMT過(guò)程中，上皮細(xì)胞逐漸失去了本身的特性，侵入上皮基底膜并通過(guò)進(jìn)入血液循環(huán)系

3、統(tǒng)獲得了浸潤(rùn)周圍組織或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的能力。除了失去胞間鏈接外，發(fā)生EMT的細(xì)胞逐漸失去了其細(xì)胞極性，上皮標(biāo)記物諸如E鈣黏蛋白減少，而N鈣黏蛋白等間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物逐漸增多，因此，具有此種特性的細(xì)胞更易向鄰近組織浸潤(rùn)性生長(zhǎng)或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。腫瘤相關(guān)的EMT并不是單一的過(guò)程，腫瘤細(xì)胞除獲得了遷移和侵襲能力外，還具備了復(fù)雜且全面地參與表觀遺傳重組、新陳代謝和分化等能力。
　　在前列腺癌病人腫瘤進(jìn)展過(guò)程中，EMT在前列腺癌由原位細(xì)胞向轉(zhuǎn)移性細(xì)胞的

4、轉(zhuǎn)化發(fā)展過(guò)程中起到了非常重要的作用，此類前列腺癌細(xì)胞失去了本身的上皮特性并獲得了間充質(zhì)細(xì)胞的特性。EMT同樣也促進(jìn)了去勢(shì)抵抗性前列腺癌的發(fā)展過(guò)程。EMT過(guò)程受體內(nèi)多個(gè)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(Transforming growth factorβ，TGF-β)信號(hào)通路起主要作用，SMAD4蛋白作為TGF-β信號(hào)通路信號(hào)傳遞過(guò)程中重要的載體蛋白，被認(rèn)為是前列腺癌的促癌因子。E3泛素連接酶-轉(zhuǎn)錄中介因子1γ（Transcripti

5、onal intermediary factor1γ，TIF1γ）被認(rèn)為通過(guò)單泛素化修飾SMAD4蛋白，促使其與磷酸化的SMAD3蛋白解離，參與了TGF-β/SMAD蛋白信號(hào)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)過(guò)程。本課題組的前期相關(guān)研究顯示，丙戊酸鈉(Valproic acid，VPA)通過(guò)抑制SMAD4蛋白的表達(dá)逆轉(zhuǎn)了前列腺癌EMT過(guò)程。
　　在本課題中，我們收集了山東省立醫(yī)院泌尿微創(chuàng)中心2012年以來(lái)收治的20例受腹腔鏡前列腺癌根治術(shù)患者的前列腺癌組

6、織及癌旁組織，應(yīng)用免疫組化技術(shù)分析SMAD4及TIF1γ蛋白在前列腺癌患者與正常人之間的不同表達(dá)水平以及各蛋白與臨床病理變量的關(guān)系;體外實(shí)驗(yàn)部分，我們運(yùn)用了免疫組化、免疫共沉淀、免疫印跡等技術(shù)，證實(shí)了TIF1γ對(duì)SMAD4蛋白的單泛素化修飾作用是介導(dǎo)VPA抑制前列腺癌EMT過(guò)程的具體分子機(jī)制。
　　研究目的
　　1.應(yīng)用生物信息學(xué)分析前列腺癌相關(guān)蛋白在前列腺癌患者與正常人之間的不同表達(dá)水平以及各蛋白與臨床病理變量的關(guān)系。

7、r>　　2.制作20例前列腺癌組織及其癌旁組織標(biāo)本的石蠟切片，應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)SMAD4及TIF1γ蛋白的表達(dá)情況。
　　3.體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)部分，分別培養(yǎng)PC3細(xì)胞及LNCaP細(xì)胞，構(gòu)建荷瘤小鼠模型，并用VPA處理，檢測(cè)TIF1γ、SMAD4及EMT過(guò)程中相關(guān)標(biāo)記蛋白在不同處理組的表達(dá)量，探討VPA抑制前列腺癌EMT過(guò)程的具體機(jī)制。
　　研究方法
　　1.應(yīng)用石蠟包埋切片技術(shù)處理臨床采集的20例前列腺癌患者的前列腺癌

8、組織及癌旁組織標(biāo)本，應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)TIF1γ、SMAD4蛋白在不同組織標(biāo)本中表達(dá)量的差異，結(jié)合患者隨訪資料，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析目的蛋白在前列腺癌患者與正常人之間不同表達(dá)水平以及各蛋白與臨床病理變量的關(guān)系，探討目的蛋白的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系，以期尋找新的前列腺癌預(yù)后指標(biāo)和潛在的治療靶點(diǎn)。
　　2.采用免疫印跡、免疫共沉淀及免疫組化等分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞及荷瘤小鼠瘤體在VPA處理組與對(duì)照組中相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，探討VP

9、A調(diào)控 TIF1γ抑制前列腺癌細(xì)胞EMT過(guò)程及其與單泛素化SMAD4蛋白之間的關(guān)系。
　　研究結(jié)果
　　1.VPA升高了野生型PC3/LNCaP細(xì)胞內(nèi)單泛素化SMAD4蛋白水平，但無(wú)法影響SMAD4點(diǎn)突變的PC3/LNCaP細(xì)胞內(nèi)單泛素化SMAD4蛋白的水平。
　　2.VPA通過(guò)調(diào)控TIF1γ蛋白抑制前列腺癌細(xì)胞EMT過(guò)程。
　　3.VPA抑制了荷瘤小鼠瘤體的生長(zhǎng)。
　　4.前列腺癌組織內(nèi)TIF1γ與SMA

10、D4蛋白含量呈負(fù)相關(guān)，免疫組化結(jié)果顯示前列腺癌組織內(nèi)TIF1γ含量明顯低于癌旁組織，SMAD4含量與上述結(jié)果相反。
　　5.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組，VPA處理組中TIF1γ表達(dá)量升高，而SMAD4蛋白表達(dá)量下降。
　　研究結(jié)論
　　VPA通過(guò)加速SMAD3/SMAD4復(fù)合物的核內(nèi)解離過(guò)程，降低核內(nèi)SMAD3/SMAD4復(fù)合物含量，從而抑制前列腺癌細(xì)胞EMT過(guò)程，TIF1γ對(duì)SMAD4的單泛素化修飾作用是VPA扣