益氣活血方調節(jié)肝臟細胞自噬及逆轉肝纖維化機制的研究.pdf

1、目的：
　　肝纖維化是慢性肝損傷的修復反應以及細胞外基質沉積和代謝失衡的結果。盡管肝纖維化的發(fā)生機制的闡明已經取得了重大進展，但仍然缺乏有效的抗肝纖維化策略。然而中藥在抗肝纖維化治療中具有多層次、多途徑、多靶點的綜合作用，我們的自擬益氣活血方是由黃芪、丹參、云苓、郁金、白豆蔻等中藥組成，具有“益氣活血，疏肝健脾”之功效，有研究發(fā)現黃芪甲苷可抑制細胞過度自噬從而發(fā)揮對受損細胞的保護作用。自噬（autophagy）是一些有缺陷的細胞器

2、和未折疊蛋白被雙層膜結構的自噬小泡包裹后，送入溶酶體中進行降解并得以循環(huán)利用從而維持細胞內平衡的代謝過程。近年研究發(fā)現，自噬能通過降解脂滴為肝星狀細胞活化提供能量，并影響肝星狀細胞的增殖及膠原纖維的產生，但自噬在肝纖維化中的作用以及益氣活血方對自噬的調控作用及分子機制尚不清楚。本研究以CCl4誘導Wistar大鼠肝纖維化模型，以扶正化瘀復方為陽性對照，應用益氣活血方進行治療研究，明確益氣活血方能否有效逆轉/延緩肝纖維化進展，并進一步探明

3、肝臟細胞自噬與肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關系，以及益氣活血方是否可通過肝臟細胞自噬阻止肝纖維化進展，為肝纖維化的防治提供新的策略及科學依據。
　　方法：
　　選用健康雄性Wistar大鼠，并隨機分為4組進行實驗研究，模型組：采用30％四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）腹腔注射建立肝纖維化模型；益氣活血方干預組：CCl4腹腔注射聯合益氣活血沖劑灌胃；扶正化瘀方干預組：CCl4腹腔注射聯合扶正化瘀復方灌胃；對

4、照組：等體積橄欖油代替CCl4及等體積的生理鹽水代替益氣活血沖劑灌胃，均喂養(yǎng)8周，水合氯醛麻醉下處死動物，留取血清標本；肝組織部分采用4%中性甲醛溶液固定，備行肝組織病理學及免疫組織化學分析，其余肝組織液氮快速冷凍后儲存于-80℃冰箱，以備蛋白及mRNA檢測。
　　1.實驗大鼠一般情況：觀察大鼠活動力、毛發(fā)、進食及存活情況。
　　2.血清生化學變化：采用全自動生化分析儀、酶法測定丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminot

5、ransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）水平。
　　3.肝組織病理學及免疫組織化學觀察：4%中性甲醛溶液固定肝組織標本，經石蠟包埋，行5μm組織切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin， HE）染色及Masson三色染色觀察肝臟炎癥及纖維化程度；采用免疫組織化學染色觀察肝組織α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-S

6、MA）和I型膠原α1鏈（alpha-1 type I collagen，Col1A1）的表達，應用Image-Pro Plus圖像分析軟件進行半定量分析，每張切片隨機選取10個視野（200×），測定α-SMA及Col1A1表達的累積光密度（integrated optical density，IOD）。
　　4.肝臟細胞自噬及纖維化相關基因表達檢測：采用-80oC冰箱儲存肝組織標本，分別提取蛋白和RNA，實時定量PCR及Weste

7、rn blot檢測肝纖維化相關基因α-SMA和Col1A1的表達及自噬相關因子自噬蛋白7（Autophagy-related gene7， Atg7）、微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein1 light chain3, LC3）及泛素結合蛋白（SQSTM1/p62）的表達。采用Image J分析系統(tǒng)軟件分析Western blot電泳條帶灰度值，計算蛋白相對表達量。
　　5.統(tǒng)計學分析

8、：所有數據以均數±標準差（x±s）表示，采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，各組間比較均采用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1.經驗動物一般情況：對照組大鼠全部存活，精神飽滿，活潑好動，毛發(fā)有光澤，攝食、飲水正常；模型組大鼠存活6只，精神萎靡，活動遲緩無力，毛發(fā)無光澤，攝食及飲水均明顯減少，造模過程中6只動物死亡；益氣活血及扶正化瘀中藥干預組分別有6只大鼠存活

9、，精神可，活動自如，毛發(fā)略有光澤，攝食、飲水可，二組各有3只動物死亡。
　　2.ALT、AST檢測：分別檢測對照組、CCl4肝纖維化模型組、益氣活血方干預組和扶正化瘀復方干預組大鼠血清ALT、AST水平，結果顯示CCl4肝纖維化模型組大鼠血清ALT、AST水平較對照組顯著升高，依次為106.80±18.24 vs38.17±4.99，278.40±66.14 vs121.00±11.87，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）；益氣活

10、血方干預組大鼠血清ALT、AST水平較CCl4肝纖維化模型組顯著降低，依次為66.80±10.42，122.60±16.65，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）；扶正化瘀復方干預組大鼠血清ALT、AST水平較CCl4肝纖維化模型組也有所改善，依次為73.20±10.33，125.4±16.92，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。
　　3.肝組織病理學變化：對照組肝小葉結構均正常，肝索排列整齊，肝板以小葉中央靜脈為中心呈放射狀排列

11、；CCl4肝纖維化模型組肝小葉結構紊亂，可見點、灶狀肝細胞壞死及竇周纖維化，匯管區(qū)纖維組織增生，纖維間隔形成（S5.64±0.22，vs對照組，P<0.01）；益氣活血方干預組肝纖維化程度較CCl4肝纖維化模型組明顯減輕（S3.70±0.35，vs模型組， P<0.01）；扶正化瘀復方干預組肝組織纖維化程度亦較模型組好轉（S3.9±0.34，vs模型組，P<0.01）。
　　4.肝組織α-SMA、Col1A1、Atg7、LC3B和

12、p62 mRNA表達：CCl4肝纖維化模型組大鼠肝組織α-SMA、Col1A1、Atg7和LC3B mRNA表達較對照組均顯著上調，p62下降，依次為0.88±0.13 vs0.19±0.07，0.99±0.075 vs0.05±0.024，1.11±0.12 vs0.33±0.07，0.92±0.072 vs0.32±0.02，1.16±0.17 vs3.18±0.18，P<0.001；與CCl4肝纖維化模型組相比，益氣活血方干預組肝

13、組織α-SMA、Col1A1、Atg7和LC3B mRNA表達明顯降低，p62上升依次為0.34±0.05，0.32±0.09，0.66±0.08，0.66±0.07，1.79±0.09，P<0.01；扶正化瘀干預組肝組織與CCl4肝纖維化模型組相比α-SMA、Col1A1、Atg7和LC3B mRNA表達明顯降低，p62略上升依次為0.48±0.043，0.31±0.11，0.74±0.07，0.58±0.03，1.45±0.03，P

14、<0.05。
　　5.肝組織α-SMA、Col1A1、Atg7、LC3BII和p62蛋白表達：CCl4肝纖維化模型組大鼠肝組織α-SMA和Col1A1累積光密度值較對照組均顯著增加，為34675.09±1200.29 vs10360.13±1442.25，22480.85±1035.92 vs2915.58±574.99，P<0.001；與CCl4肝纖維化模型組相比，益氣活血方干預組肝組織α-SMA和 Col1A1累積光密度值均明

15、顯下降，分別為22051.47±1610.70、12565.8±932.23，P<0.001；扶正化瘀復方干預組與CCl4肝纖維化模型組相比肝組織α-SMA和Col1A1累積光密度值亦明顯下降，分別為22556.52±1510.60、12997.9±903.85，P<0.001；CCl4肝纖維化模型組小鼠肝組織α-SMA、Col1A1、Atg7和LC3BII蛋白表達較對照組均顯著增強，依次為0.83±0.05 vs0.05±0.006，

16、0.73±0.002 vs0.29±0.02，0.12±0.002 vs0.06±0.002，0.83±0.024 vs0.53±0.02，P<0.001；益氣活血方干預組肝組織α-SMA、Col1A1、Atg7和LC3BII蛋白表達明顯降低，依次為0.19±0.02，0.35±0.003，0.10±0.002，0.67±0.02，P<0.001；扶正化瘀復方干預組肝組織α-SMA、Col1A1、Atg7和LC3BII蛋白表達也明顯降低

17、，依次為0.31±0.02，0.47±0.003，0.10±0.003，0.62±0.03，P<0.001；CCl4肝纖維化模型組小鼠肝組織p62蛋白表達較對照組均顯著降低，為0.26±0.02 vs0.68±0.03，P<0.001；益氣活血方和扶正化瘀方干預組肝組織p62蛋白表達均明顯改善，分別為0.45±0.02，0.35±0.04，P<0.001。
　　結論：
　　1.肝臟細胞自噬可能為肝纖維化發(fā)生發(fā)展的重要機制之一