麥長管蚜翅型分化相關(guān)的生態(tài)學(xué)及microRNA水平的分子機(jī)理研究.pdf

1、蚜蟲是研究翅二型性的理想模式昆蟲，可結(jié)合遺傳因素和環(huán)境因素變化研究翅分化機(jī)制。由于外界環(huán)境因子的影響，蚜蟲在發(fā)育過程中呈現(xiàn)兩種不同的生物型，有翅蚜和無翅蚜。這種表觀形態(tài)的變化主要是由于受到環(huán)境因子的脅迫，通過選擇性地表達(dá)基因從而達(dá)到了調(diào)控的作用，這屬于典型的表觀遺傳學(xué)范疇。microRNA(miRNA)作為重要的后轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控因子，參與生物生長發(fā)育的各個生命過程，是表觀遺傳學(xué)的重要研究內(nèi)容。隨著近年來大量昆蟲miRNAs的鑒定，明確其在

2、昆蟲生長發(fā)育中的作用已成為新的研究熱點(diǎn)，而且從miRNA角度對昆蟲翅發(fā)育的研究也取得了一些進(jìn)展。因此，開展麥長管蚜翅型分化相關(guān)的生態(tài)學(xué)及miRNA水平的分子機(jī)理方面的研究，為解析麥蚜的翅型分化機(jī)理奠定一定的理論基礎(chǔ)。
　　本研究利用體視顯微鏡、掃描電鏡技術(shù)對麥長管蚜不同翅型不同齡期成若蚜的形態(tài)測量學(xué)和外部形態(tài)特征進(jìn)行研究;通過設(shè)定不同的外界因子，對麥長管蚜翅型分化的生態(tài)學(xué)進(jìn)行研究;運(yùn)用高通量測序和qRT-PCR等技術(shù)，對麥長管蚜翅

3、型分化的miRNA調(diào)控機(jī)理方面進(jìn)行了研究。主要得到以下研究結(jié)果:
　　首先對麥長管蚜不同翅型不同齡期成若蚜的形態(tài)測量學(xué)和外部形態(tài)特征進(jìn)行研究，結(jié)果表明麥長管蚜1、2齡若蚜外部形態(tài)無明顯差別，觸角均為5節(jié);3齡有翅若蚜中胸發(fā)達(dá)，可見初生翅芽，至成蟲期發(fā)育為完整的翅;3齡無翅若蚜中胸結(jié)構(gòu)簡單，未見翅芽，3齡至成蚜觸角均為6節(jié);1齡若蚜尾片呈瘤狀，著生2根剛毛;2、3、4齡若蚜尾片呈圓錐形;有翅成蚜尾片呈長錐形，無翅成蚜呈長舌狀，2齡若

4、蚜至成蚜尾片均著生6根以上剛毛;1齡到3齡若蚜腹管的外部形態(tài)基本相似，呈圓柱狀，4齡若蚜腹管端部開始膨大，近端部變細(xì)。有翅成蚜和無翅成蚜腹管基本無差異，與若蚜相比，近頂端表面均呈現(xiàn)多角形網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
　　通過設(shè)定不同的擁擠度、溫度、母代效應(yīng)、寄主營養(yǎng)等因素，觀察對麥長管蚜翅型分化影響。結(jié)果表明初產(chǎn)若蚜的擁擠度越大，越有利于其形成有翅個體;較高的溫度和較低的溫度處理?xiàng)l件下，均有利于麥長管蚜初齡若蚜有翅蚜的形成;擁擠處理母代，對后代個體

5、的翅型分化存在影響，處理不同翅型的母代對后代個體翅型分化也存在差異;寄主營養(yǎng)不僅影響當(dāng)代若蚜表型的變化，同樣影響第二代的表型變化。
　　通過構(gòu)建麥長管蚜有翅成蚜和無翅成蚜的miRNAs文庫，利用高通量測序技術(shù)及生物信息學(xué)分析方法，測序結(jié)果中一共得到了146個保守的miRNAs，152個新的miRNAs，且34％以上的miRNAs的長度分布在22nt，這符合典型的miRNAs長度分布。采用數(shù)據(jù)歸一化和差異檢驗(yàn)方法（P值小于0.1、0

6、.05以及0.01），篩選出52個表達(dá)差異顯著miRNAs，其中30個上調(diào)控的miRNAs和22個下調(diào)控的miRNAs。通過預(yù)測差異表達(dá)的miRNAs的靶基因，利用基因本體論GO、KEGG信號通路分析，初步篩選出可能與麥長管蚜翅型分化相關(guān)的9個miRNAs，包括7個保守的miRNAs（Let-7、miR-1_ L-1、miR-7、miR-277、miR-8、mR-9a_ R-2和miR-315）和2個新的miRNAs(PC-5p-113

7、190_15和PC-3p-2743_844)。通過qRT-PCR技術(shù)分析9個miRNAs在兩翅型中的表達(dá)譜，結(jié)果表明9個miRNAs在有翅成蚜中的表達(dá)量均高于無翅成蚜中的表達(dá)量，且有5個保守的miRNAs(Let-7、miR-1_L-1、miR-7、miR-277和miR-8)的表達(dá)量差異顯著，推測這些miRNAs可能在麥長管蚜的翅型發(fā)育中起重要調(diào)控作用。
　　通過構(gòu)建麥長管蚜翅型分化敏感期（有翅蚜和無翅蚜的偽胚胎、1齡和2齡）的

8、miRNAs文庫，經(jīng)過初步過濾篩選得到60％的clean數(shù)據(jù)可用于后續(xù)的生物信息學(xué)分析。預(yù)測得到保守的pre-miRNA85個，unique-miRNA150個，新預(yù)測得到的新的pre-miRNA1050個，unique miRNA1016個。通過差異檢驗(yàn)方法對兩兩數(shù)據(jù)庫進(jìn)行差異比對，發(fā)現(xiàn)大量差異表達(dá)的miRNAs。將預(yù)測得到的保守的miRNAs與其他昆蟲的miRNAs進(jìn)行保守性分析，表明其與鄰近物種豌豆蚜Acyrthosiphon p

9、isum保守性較高，其次是赤擬谷盜Tribolium castaneum和家蠶Bombyx mori。通過qRT-PCR技術(shù)對9個miRNAs在兩翅型不同齡期的表達(dá)譜進(jìn)行分析，表明不同miRNAs在麥長管蚜不同的翅型和不同發(fā)育階段的相對表達(dá)量不同，進(jìn)一步地揭示miRNAs表達(dá)的特異性和時序性。
　　選擇兩個前期預(yù)測得到的可能與麥長管蚜的翅型分化相關(guān)miRNAs（miR-7和miR-277），根據(jù)miRNA的成熟序列設(shè)計(jì)，人工合成雙

10、鏈小RNA(miRNA agomir)，通過模擬體內(nèi)miRNA，與靶基因相互配對，增強(qiáng)miRNAs在體內(nèi)的表達(dá)。用人工飼料將miRNA agomir稀釋至300 nM，將單頭飼養(yǎng)三代的無翅成蚜初產(chǎn)24 h內(nèi)的若蚜，每10頭放入含有相應(yīng)miRNA agomir的飼蚜器中飼喂不同的時間。運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)檢測miRNA agomir的過表達(dá)效應(yīng)，結(jié)果表明，與對照相比，隨著飼喂時間的延長，目的基因miR-7和miR-277的表達(dá)量也隨著增