葛根黃酮體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)與神經(jīng)活性及其增強(qiáng)桑白皮降糖活性機(jī)制的研究.pdf

1、葛根為豆科植物野葛、甘葛藤的干燥根，性涼，味甘、辛，歸脾、胃經(jīng)，具有發(fā)表解肌、升陽(yáng)透疹的功效，其主要成分是黃酮類物質(zhì)，總量可達(dá)12％，由葛根素、黃豆苷及黃豆苷元等組成，葛根黃酮具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈和腦血管、改善微循環(huán)、抗氧化、清除自由基和抗缺血性腦損傷等作用。臨床上葛根黃酮制劑主要用于心腦血管疾病的治療。目前對(duì)葛根黃酮的研究大多集中在葛根素和大豆苷兩種主要的活性化合物上，對(duì)其他活性化合物及葛根總黃酮的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究仍有待進(jìn)一步加強(qiáng)。

2、r>　　本研究從藥代動(dòng)力學(xué)和藥效動(dòng)力學(xué)角度研究了葛根黃酮的腦神經(jīng)活性作用物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制，并探討了葛根黃酮提高桑白皮活性的降糖機(jī)制，主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　第一部分:葛根黃酮的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)和藥效動(dòng)力學(xué)研究
　　1、建立生物樣品中5個(gè)葛根黃酮化合物的UFLC-MS/MS檢測(cè)方法
　　首次建立高效、靈敏、穩(wěn)定可靠地UFLC-MS/MS分析方法，測(cè)定5個(gè)葛根黃酮化合物，葛根素(PU)、大豆苷元（DA）、3'-甲氧

3、基葛根素(MPU)、3'-羥基葛根素(HPU)以及大豆苷元-8-c-芹菜糖基葡萄糖苷(DAC)在大鼠血漿及腦微透析液中的濃度。分析選用Thermo Syncronis C18柱，流動(dòng)相為乙腈和水（含0.2％的甲酸）。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示，該方法具有良好的線性。PU、MPU、HPU、DA、DAC在血漿中的最低檢測(cè)限分別為5.00、1.00、5.00、10.00、10.00 ng/mL，最低定量限分別為1.00、0.50、2.00、5.00、

4、2.00 ng/mL，在人工腦脊液中的最低檢測(cè)限分別為2.00、0.50、1.00、5.00和5.00 ng/mL，最低定量限為5.00、1.00、2.00、10.00和10.00 ng/mL。該方法同時(shí)呈現(xiàn)出了良好的精密度(RSD＜13.87％)和準(zhǔn)確度(Bia＜12.45％)，血漿樣品提取回收率在75％-101％范圍內(nèi)，均能滿足生物樣品測(cè)定要求。
　　2、葛根黃酮在大鼠血漿及腦脊液中的藥代動(dòng)力學(xué)特性研究
　　首次結(jié)合微透

5、析技術(shù)與UFLC-MS/MS檢測(cè)方法，研究葛根總黃酮(RPIF)靜脈給藥后5個(gè)黃酮化合物在大鼠腦脊液及血漿中的藥代動(dòng)力學(xué)行為特征，評(píng)價(jià)其血-腦脊液透過(guò)特性。結(jié)果顯示，靜脈給予RPIF（80 mg/kg）后，PU、MPU、DA、DAC以及HPU在血漿中的C0分別為6.53、13.72、1.54、15.84和86.07μg/mL，其AUC0-t分別為7.30、6.47、0.66、8.39以及32.18μg·h/mL，PU、MPU、DA、DA

6、C四個(gè)化合物能進(jìn)入大鼠腦脊液中，并在0.5-0.8h內(nèi)達(dá)到血藥濃度峰值(Cmax)，分別為521.52、415.00、74.34和380.03 ng/mL，AUC0-t分別為0.70、0.55、0.10以及0.35μg·h/mL。5個(gè)化合物在血漿與腦脊液中的半衰期t1/2均在1h以內(nèi)，給藥后3-4 h基本檢測(cè)不到，表明葛根黃酮化合物在體內(nèi)迅速消除。PU、MPU、DA和DAC的血腦屏障透過(guò)率為9.58％、8.50％、15.15％和4.17

7、％，腦脊液透析液中未檢測(cè)到HPU。推測(cè)PU、MPU可能是葛根總黃酮產(chǎn)生腦保護(hù)作用的主要活性物質(zhì)。
　　3、葛根黃酮在腦鼠紋狀體中的藥物代謝動(dòng)力學(xué)與藥效動(dòng)力學(xué)研究
　　首次結(jié)合微透析技術(shù)與UFLC-MS/MS檢測(cè)方法，研究5個(gè)葛根黃酮化合物在紋狀體組織中的藥代動(dòng)力學(xué)行為及其對(duì)紋狀體細(xì)胞外液中多巴胺(DOA)、谷氨酸(Glu)、5-羥色胺（5-HT）、高香草醛酸(HVA)、5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)、乙酰膽堿(Ach)以及γ

8、-氨基丁酸(GABA)7種神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響，進(jìn)一步從藥代動(dòng)力學(xué)和藥效動(dòng)力學(xué)的角度研究其腦神經(jīng)活性的作用機(jī)制。結(jié)果顯示，大鼠靜脈給予RPIF后(80 mg/kg)，PU、HPU、DAC和MPU在大鼠紋狀體中的Cmax分別為2.19、1.30、1.02和0.65μg/mL,AUC0-t為2.14、1.40、1.11和1.02μg·h/mL。PU、HPU和DAC的半衰期t1/2均在0.3 h左右，MPU的t1/2為1.2 h。增大RPIF給

9、藥劑量后(160 mg/kg)，PU、MPU、HPU、DAC的Cmax分別升高一倍左右，AUC0-t也相應(yīng)增大。DA在紋狀體透析液中的含量極低，無(wú)法進(jìn)行定量分析。
　　對(duì)紋狀體中神經(jīng)遞質(zhì)濃度檢測(cè)結(jié)果顯示，在80 mg/kg劑量下，靜脈給予RPIF可降低正常大鼠紋狀體中的DOA和其代謝產(chǎn)物HVA水平，DOA的濃度由81ng/mL，最低降至45 ng/mL，HVA的濃度由2320 ng/mL下降至1810 ng/mL左右。觀測(cè)GLu濃

10、度，未發(fā)現(xiàn)顯著性變化。GABA的基礎(chǔ)水平為154 ng/mL，在給藥后1.5h一過(guò)性降低，隨后升高至197 ng/mL，然后又呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。5-HT濃度未發(fā)現(xiàn)明顯變化，其代謝產(chǎn)物5-HIAA的濃度降低，在給藥后2h由529 ng/mL下降至331ng/mL。Ach在紋狀體中的基礎(chǔ)水平為32 ng/mL，給藥后無(wú)明顯變化。在160 mg/kg劑量下，靜脈給予RPIF對(duì)紋狀體中DOA水平?jīng)]有影響，但可升高HVA水平。在該劑量下，RPIF可顯

11、著降低紋狀體中GLu的水平，給藥后2 h GLu含量由1558ng/mL降至最低，為301 ng/mL，而對(duì)GABA水平無(wú)影響。給藥后5-HT含量無(wú)明顯變化，其代謝物5-HIAA水平升高。Ach水平呈現(xiàn)波動(dòng)性升高。由此可見(jiàn)在低劑量和高劑量時(shí)，RPIF對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)含量變化的作用不盡相同。
　　本部分研究結(jié)果揭示了RPIF的主要成分PU、MPU、DA、DAC和HPU在大鼠血漿、腦脊液和紋狀體中的藥代動(dòng)力學(xué)特性和血腦屏障透過(guò)特性，及其對(duì)紋

12、狀體細(xì)胞外液中神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響，為其腦神經(jīng)活性機(jī)制的研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第二部分:葛根黃酮增強(qiáng)桑白皮降糖活性的機(jī)制研究
　　1-脫氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin，DNJ)是桑白皮降糖活性的主要有效成分，通過(guò)在腸道內(nèi)抑制α-酸性葡萄糖苷酶活性而發(fā)揮降低餐后血糖作用。葛根黃酮可顯著增強(qiáng)桑白皮提取物（富含DNJ）的降糖活性，為了解和揭示葛根黃酮和桑白皮提取物的配伍增效機(jī)制，本部分研究了葛根黃酮對(duì)桑白皮提取

13、物中主要活性成分DNJ的藥代動(dòng)力學(xué)行為和腸吸收特性的影響，主要研究結(jié)果如下:
　　1、葛根黃酮對(duì)桑白皮提取物降糖活性的影響
　　通過(guò)觀測(cè)RPIF、桑白皮提取物(CME)及桑葛復(fù)方提取物(CME-RPIF)對(duì)大鼠糖耐量的影響，評(píng)價(jià)其單獨(dú)及配伍應(yīng)用時(shí)的降糖活性。結(jié)果顯示，CME-RPIF可顯著抑制口服淀粉溶液后血糖的升高。空白對(duì)照組、CME、RPIF和CME-RPIF組的血糖AUC0-t分別為8.71、7.52、7.68和5.1

14、6 h/mmol*L。CME-RPIF組血糖AUC與空白對(duì)照組比較明顯降低，降低幅度為40.8％，而CME組和RPIF組則降低的較少，分別為13.6％和11.8％，且無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明CME與RPIF聯(lián)用時(shí)，降糖活性得到顯著提高。
　　2、建立生物樣品中DNJ的LC-MS/MS含量測(cè)定方法
　　建立了專屬，靈敏的LC-MS/MS方法以測(cè)定大鼠血漿、尿液等生物樣品中DNJ的濃度，該方法具有良好的線性，DNJ的最低檢測(cè)限為5ng

15、/mL，最低定量限為10ng/mL，同時(shí)呈現(xiàn)出較好精密度(RSD＜16.09％)和準(zhǔn)確度(Bias＜13.37)，血漿樣品提取回收率在80.3-96.9％之間，均能達(dá)到生物樣品分析方法學(xué)要求。
　　3、葛根黃酮對(duì)桑白皮提取物中DNJ體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)行為及腸吸收特性的的影響
　　首次以體內(nèi)整體實(shí)驗(yàn)大鼠模型、大鼠在體腸灌流模型和Caco-2細(xì)胞單層模型研究了葛根黃酮對(duì)桑白皮降糖有效成分DNJ的吸收和排泄的影響。研究結(jié)果表明，大鼠口

16、服CME（DNJ20 mg/kg或40 mg/kg）后，DNJ在0.4 h或0.35 h達(dá)到最大血藥濃度5.79μg/mL或10.66μg/mL。而給予CME-RPIF后(DNJ20 mg/kg或40 mg/kg)，大鼠對(duì)DNJ的吸收延緩，平均達(dá)峰時(shí)間為0.55h或0.6 h，峰濃度明顯降低至2.94μg/mL或5.56μg/mL。同時(shí)給藥后0-4 h內(nèi)DNJ在尿液中的累積排泄率由48.76％降至33.86％，比較兩組的半衰期未發(fā)現(xiàn)顯著

17、性變化，表明RPIF只改變DNJ的吸收速率，對(duì)其消除沒(méi)有影響。以CME-RPIF對(duì)大鼠進(jìn)行單向腸灌流時(shí)DNJ的有效滲透系數(shù)Peff為3.52×10-3 cm/min，遠(yuǎn)低于以CME灌流時(shí)的Peff7.53×10-3 cm/min。此結(jié)果表明，以CME-RPIF灌流時(shí)DNJ在大鼠腸道內(nèi)的吸收受到顯著抑制。在Caco-2細(xì)胞上進(jìn)行DNJ的吸收特性研究結(jié)果表明，RPIF可顯著抑制10μg/mL DNJ的吸收，使其表觀通透系數(shù)Papp值由2.7