生孢噬纖維菌JL-01降解纖維素特性的研究.pdf

1、生孢噬纖維菌是能夠降解纖維素的滑動(dòng)細(xì)菌，對(duì)纖維素有著較強(qiáng)的降解作用，但是其纖維素降解特性一直缺乏深入的研究，本論文對(duì)生孢噬纖維菌JL—01的固液培養(yǎng)特性、發(fā)酵過程中pH值和糖含量變化的測(cè)定、酶活測(cè)定方法的總結(jié)、產(chǎn)酶條件的優(yōu)化和FPase的分離純化進(jìn)一步闡明Sporocytophagasp．JL—01對(duì)纖維素的降解機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果具體如下： 1．在生孢噬纖維菌JL—01濾紙纖維素固體平板培養(yǎng)的過程中，168小時(shí)發(fā)現(xiàn)濾紙已經(jīng)完全被分解

2、。在CF11纖維素粉固體平板培養(yǎng)的過程中，CF11纖維素粉在192小時(shí)幾乎被完全降解。濾紙纖維素液體培養(yǎng)的過程中，144小時(shí)濾紙完全被分解。無(wú)論是固體培養(yǎng)還是液體培養(yǎng)，JL—01對(duì)濾紙的降解效果要好于SD—02。 2．Sporocytophagasp．JL—01和SD—02在進(jìn)行濾紙纖維素液體培養(yǎng)時(shí)，PH值都有上升的現(xiàn)象，并且發(fā)酵液中無(wú)還原糖的產(chǎn)生，而且發(fā)酵液總糖含量在不斷的增加，前兩種現(xiàn)象與纖維素霉菌發(fā)酵時(shí)是完全不同的，這說(shuō)明

3、在Sporocytophagasp．JL—01和SD—02在發(fā)酵過程中，可能是由于大量的堿性物質(zhì)的生成導(dǎo)致pH的上升，并且有可能存在著特殊的糖代謝途徑；在以葡萄糖為碳源液體發(fā)酵時(shí)，pH值都有下降的現(xiàn)象。綜合Sporocytophagasp．JL—01和SD—02在液體發(fā)酵的現(xiàn)象，說(shuō)明兩株菌在分別以濾紙纖維素和葡萄糖為唯一碳源時(shí)，糖代謝的途徑也不相同，這樣造成了pH值上升和下降以及發(fā)酵液中還原糖檢測(cè)不到的現(xiàn)象。原因可能是因?yàn)樘荚床煌?，菌體

4、所產(chǎn)的酶系也不同。 3．在FPase酶活測(cè)定過程中考察了酶液與緩沖液比例、酶解反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)短、pH大小、濾紙?zhí)幚砼c否對(duì)產(chǎn)生還原糖的影響，并且確定了酶液與緩沖液比例為1：1、反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)、pH值為7、以處理過的濾紙為底物時(shí)可以檢測(cè)到FPase的酶活。由于方法的原因而未能檢測(cè)到還原糖的存在就說(shuō)纖維素細(xì)菌不存在FPase是不科學(xué)的。并且在酶活的測(cè)定過程中發(fā)現(xiàn)CMCase最適pH值是5．0，F(xiàn)Pase的最適pH值是7．0，從酶學(xué)性質(zhì)上

5、來(lái)講，可以猜測(cè)Sporocytophagasp．JL—01纖維素酶系可能是由酸性纖維素酶和堿性纖維素酶共同組成的。 4．在Sporocytophagasp．JL—01最佳產(chǎn)FPase條件的優(yōu)化的過程中，從時(shí)間、接種量、溫度、pH值、搖床轉(zhuǎn)數(shù)五個(gè)因素對(duì)Sporocytophagasp．JL—01進(jìn)行了最佳產(chǎn)FPase條件的優(yōu)化，旨在為后續(xù)的FPase分離純化工作提供充足的FPase粗樣，因?yàn)镕Pase酶活性的低值有可能是因?yàn)榇税?/p>

6、酶含量極少的原因，優(yōu)化結(jié)果為接種量為5％，培養(yǎng)溫度30℃，pH值7．2，搖床轉(zhuǎn)數(shù)為120r/min，培養(yǎng)時(shí)間120h，并按照此優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果好于優(yōu)化前結(jié)果。 5．在FPase分離純化的過程中，粗酶液經(jīng)過超濾濃縮后，采用了硫酸銨和CTAB對(duì)樣品的聯(lián)合處理方法，再經(jīng)過SepharoseCL-6B制備柱的處理，除去了雜蛋白和大部分的雜多糖。最后經(jīng)分析用Sephacryls-100和DEAE—SephadexG-50得到

7、單一組分，收集組分透析凍干進(jìn)行電泳分析和酶學(xué)性質(zhì)分析，電泳結(jié)果為FPase為單一條帶，分子量為55．4KD，酶學(xué)的性質(zhì)為FPase最適反應(yīng)pH值為7．2，在pH值6．8-7．4范圍內(nèi)穩(wěn)定，該酶最適反應(yīng)溫度為50℃，在30℃-50℃穩(wěn)定，2n2+和Co2+對(duì)FPase活力有一定的促進(jìn)作用，F(xiàn)e3+對(duì)它有很強(qiáng)的抑制作用，而Ca2+、Mg2+和Na+對(duì)酶活力基本沒有影響。 在實(shí)驗(yàn)過程中考察了FPase對(duì)底物專一性的研究，F(xiàn)Pase對(duì)C

8、MC也有一定的催化能力，且與濾紙酶活的比值近10：1，這就說(shuō)明了在濾紙的降解過程中，此酶組分存在著雙功能的作用，一方面對(duì)結(jié)晶區(qū)纖維素的催化能力并且從纖維素的兩端切下二糖單元，另一方面又能發(fā)揮水解非結(jié)晶區(qū)的作用，可以猜測(cè)FPase在結(jié)構(gòu)上有著多個(gè)功能域（或者說(shuō)是一個(gè)雙功能酶）（endoglucanase和CBH），它們共同協(xié)同從而達(dá)到高效降解纖維素的作用。使從濾紙降解的速率方面考慮，此酶具有高效性和多功能性的特點(diǎn)。由此可以推斷，在細(xì)菌FP