穩(wěn)定表達pAcGFP1-Actin蛋白PC12細胞系的建立及在細胞骨架研究中的應用.pdf

1、PC12細胞系克隆于大鼠嗜鉻細胞瘤，它在神經(jīng)生長因子（NGF）的誘導下，能夠向神經(jīng)元細胞方向分化，并具有神經(jīng)元細胞的很多生理特征，因此PC12細胞作為一種模型細胞被廣泛使用。本論文目的是建立能夠穩(wěn)定表達GFP-Actin融合蛋白的PC12細胞系，并在此基礎上初步探究外界物理刺激和脂質(zhì)體對細胞骨架的影響。Actin蛋白作為細胞骨架的基本組成單位，在細胞骨架的建立、重構(gòu)以及細胞遷移等正常生理活動中有重要作用，對Actin蛋白進行熒光標記就可

2、以對PC12細胞骨架進行實時觀察，而綠色熒光蛋白（GFP）能夠在很多不同的細胞中穩(wěn)定表達，其發(fā)出的熒光穩(wěn)定，不易淬滅，在細胞中表達對細胞沒有毒性，被廣泛的用于細胞內(nèi)熒光觀察。因此，建立能夠穩(wěn)定表達GFP-Actin融合蛋白的細胞系就能夠?qū)崿F(xiàn)對PC12細胞骨架的實時觀察。
　　 本研究使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將含有pAcGFP1-Actin基因序列的真核表達質(zhì)粒載體導入PC12細胞內(nèi)，同時使用陽離子聚合物為載體介導轉(zhuǎn)染，以比較兩種介導材

3、料的效率高低。通過G418篩選，建立穩(wěn)定表達pAcGFP1-Actin融合蛋白的PC12細胞系。在這個基礎上，初步探究生物相容性材料脂質(zhì)體對PC12細胞的微絲性骨架的影響以及AFM針尖對PC12細胞骨架局部刺激后細胞骨架的變化。本論文的主要研究工作分為三部分：
　　 首先，利用脂質(zhì)體和陽離子聚合物介導的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將含有pAcGFP1-Actin基因序列的真核表達質(zhì)粒導入正常的PC12細胞，并比較兩種載體的轉(zhuǎn)染效率。使用G418

4、篩選，建立穩(wěn)定表達pAcGFP1-Actin蛋白的PC12細胞系。
　　 其次，用乙醇注入法制備脂質(zhì)體，用不同濃度的脂質(zhì)體溶液與PCl2細胞共培養(yǎng)，觀察細胞在脂質(zhì)體存在的條件下細胞骨架的變化，從而評估脂質(zhì)體對PC12細胞骨架的影響。
　　 最后，利用原子力顯微鏡的針尖對PC12細胞表面進行局部物理刺激，用熒光倒置顯微鏡實時觀察細胞骨架的修復情況。
　　 使用陽離子聚合物和脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染方法，都成功的構(gòu)建了穩(wěn)定表