急慢性酒精中毒大鼠腦組織S-100β、MBP表達(dá)與TSAH死亡關(guān)系的研究.pdf

1、背景與目的：外傷性蛛網(wǎng)膜下腔出血(traumatic subarachnoid haemorrhage,TSAH)是一種不同于腦挫傷所致的蛛網(wǎng)膜下腔出血和病理性蛛網(wǎng)膜下腔出血的獨(dú)立蛛網(wǎng)膜下腔出血，與外傷性硬腦膜外出血、硬腦膜下腔出血并列為三大外傷性顱內(nèi)腔隙出血。國(guó)內(nèi)外學(xué)者報(bào)道的TSAH常與酗酒有關(guān)，但其發(fā)生及死亡機(jī)制的研究性報(bào)道較少見(jiàn)。因此，探討和闡釋急慢性酒精中毒相關(guān)的TSAH發(fā)生及死亡機(jī)制，可為其死因分析、司法審判量刑提供科學(xué)的理論

2、依據(jù)。
　　 本課題組前期工作已成功地建立了大鼠急慢性酒精中毒TSAH模型，結(jié)果顯示，腦震蕩性輕微外力打擊灌酒后大鼠的TSAH發(fā)生率：慢性組82.4﹪、急性組28.6%，死亡率：慢性組58.8﹪、急性組0﹪，慢性灌酒組TSAH發(fā)生率及死亡率遠(yuǎn)大于急性灌酒組。并從MMP-9 血管壁毒性物質(zhì)、血管壁形態(tài)結(jié)構(gòu)及其生物力學(xué)，Ngb、Hif-1α、EPO、Na+,K+-ATPase等腦氧和能量代謝物，tPA、Cyt-C、Caspase-9

3、、Caspase-3、Bcl-2、Bax 等細(xì)胞凋亡相關(guān)物質(zhì)，證實(shí)了酒精的綜合性毒理學(xué)作用在TSAH發(fā)生及死亡機(jī)制中具有重要作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)是在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討慢性灌酒大鼠TSAH高死亡率與膠質(zhì)細(xì)胞改變的關(guān)系，選擇與中樞神經(jīng)纖維功能結(jié)構(gòu)密切相關(guān)的膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物S-100β、MBP，探討急慢性酒精中毒情況下腦組織S-100β、MBp的表達(dá)，及其與大鼠TSAH死亡機(jī)制的相關(guān)性。
　　 材料與方法
　　

4、1 動(dòng)物模型及分組：SPF級(jí)成年雄性SD大鼠61只，體重300±50g，分籠適應(yīng)性飼養(yǎng)2周，隨機(jī)分組。
　　 1.1 急性灌酒模型28只大鼠隨機(jī)分急性單純灌酒組、急性灌酒打擊組、急性單純灌水組、灌水打擊組共4組，每組7只。灌酒組一次性白酒（北京紅星酒廠二鍋頭，52%v/v）灌胃15ml/kg；灌水組同等劑量的食用水灌胃。打擊組在灌白酒或食用水后2h，給予腦震蕩性打擊。
　　 1.2 慢性灌酒模型33只大鼠隨機(jī)分為慢性單純

5、灌酒組7只、慢性灌酒停酒打擊組7只、慢性灌酒打擊組19只（其中死亡10只歸為死亡組，存活9只歸為存活組)共4組。各組大鼠給予白酒灌胃(北京紅星酒廠二鍋頭，52%v/v)，一天兩次，間隔8小時(shí)，前2周每次予灌胃劑量8ml/kg、后2周每次灌胃劑量予12ml/kg，最后一次灌酒后2h，慢性灌酒停酒打擊組于灌酒后12h，給予腦震蕩性打擊。
　　 2 方法
　　 各灌酒打擊和灌水打擊組大鼠予腦震蕩打擊后，放置4h 予乙醚麻醉，開(kāi)

6、胸左心室取血5ml，死亡的大鼠立即開(kāi)胸取血5ml，經(jīng)左心室-主動(dòng)脈插管，灌注4%中性多聚甲醛液處死兼固定腦組織，開(kāi)顱取全腦，置于4%中性多聚甲醛固定、取材，常規(guī)石蠟包埋、HE切片染色，固綠（Fast green）髓鞘染色觀察腦組織及髓鞘組織形態(tài)學(xué)，S-100β、MBp免疫組化染色，Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件體視學(xué)量化組織病理學(xué)觀測(cè)，BAC檢測(cè)。所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS15.0 統(tǒng)計(jì)軟件，t檢驗(yàn)和單因素方差、卡方檢驗(yàn)

7、統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果
　　 1 急慢性酒精中毒大鼠行為學(xué)表現(xiàn)和BAC 變化
　　 急性灌酒組大鼠灌酒后0.5h 內(nèi)活動(dòng)增多、不停張望，呈興奮狀態(tài)，之后活動(dòng)減少、步態(tài)不穩(wěn)、動(dòng)作笨拙，呈昏睡、呼吸緩慢，反應(yīng)遲鈍等醉酒表現(xiàn)。灌酒后2h 血酒精濃度（BAC）180.16±16.58 mg/dL、血壓14.13±0.34 Kpa，較灌酒前血壓17.02±0.88 Kpa 顯著下降(P<0.01)；灌水組灌胃后行為及血壓均

8、無(wú)明顯變化(P>0.05)。
　　 慢性灌酒組大鼠灌酒期間，逐漸出現(xiàn)消瘦、營(yíng)養(yǎng)不良、進(jìn)食減少，精神萎靡、部分一側(cè)肢體偏癱等慢性酒精中毒改變，4w后體重251.8±19.6g 較灌胃前307.2±28.9g 明顯下降(P<0.01)、血壓18.16±0.82Kpa 較灌胃前16.60±0.76Kpa 明顯增高(P<0.01)。灌酒后0.5h 內(nèi)呈側(cè)臥、昏睡、翻正反射消失等急性酒精中毒表現(xiàn)，最后一次灌酒2h后BAC 208.50 ±

9、 32.35mg/dL 高于急性組。
　　 2 TSAH發(fā)生率、死亡率及病理學(xué)觀察
　　 急性灌酒打擊組大鼠TSAH發(fā)生率為28.6%，無(wú)死亡，灌水打擊組未見(jiàn)TSAH發(fā)生及死亡；慢性灌酒打擊組的TSAH發(fā)生率為84.2%、死亡率52.6%，慢性灌酒停酒打擊組的TSAH發(fā)生率為71.4%、死亡率28.6%，死亡率較慢性灌酒打擊組有顯著差異(P<0.01)。
　　 急性單純灌水組大腦表面散在局限性淤血；急性灌水打擊組

10、大鼠腦表面光滑，呈蠟樣蒼白；急性單純灌酒組大鼠額葉及小腦表面大片淤血；急性灌酒打擊組發(fā)生TSAH的大鼠腦表面及腦干背側(cè)、腹側(cè)斑片狀薄層SAH；慢性灌酒打擊組發(fā)生TSAH的大鼠全腦彌漫厚層SAH，以腦干腹側(cè)面為重。
　　 組織學(xué)檢查，急性灌酒組腦神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞輕度水變性、細(xì)胞周隙輕度擴(kuò)大，打擊組腦干及小腦薄層SAH。慢性灌酒組腦皮質(zhì)各層神經(jīng)元排列紊亂、數(shù)目減少、核固縮，多見(jiàn)噬神經(jīng)現(xiàn)象；小腦蒲肯野細(xì)胞疏松較少、胞體三角形固縮變

11、小、突起減少、核固縮深染，部分溶解消失；延腦多見(jiàn)均質(zhì)化胞漿深染固縮、核固縮的暗神經(jīng)元（Dark cell)；打擊組腦干、額頂、小腦等處大片厚層SAH。
　　 固綠髓鞘染色（髓鞘呈深綠色、細(xì)胞核呈紅色），急性單純灌水組腦干、胼胝體及小腦神經(jīng)纖維髓鞘平直、排列緊密；急性灌酒打擊組的髓鞘排列稍疏松、間隙大，著色稍淡；
　　 慢性打擊組的髓鞘疏松、間隙增大，著色淺淡不均，腦干可見(jiàn)明顯不規(guī)則增粗扭曲、斷裂神經(jīng)纖維，周隙明顯擴(kuò)大。<

12、br>　　 3 S-100β蛋白、MBp的表達(dá)
　　 3.1 S-100β蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)急性灌酒打擊組和灌水打擊組大鼠各腦區(qū)S-100β陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均顯著多于急性灌酒和急性單純灌水組(P<0.05)；打擊組之間、單純組之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 慢性灌酒打擊存活組和慢性灌酒停酒打擊存活組大鼠各腦區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均顯著多于慢性單純灌酒組和慢性灌酒打擊死亡組(P<0.05)；慢性灌酒打擊存活組和慢性灌酒停酒打擊存

13、活組之間、慢性單純灌酒組和慢性灌酒打擊死亡組之間均無(wú)顯著差異(P>0.05)。
　　 慢性灌酒打擊存活組和慢性灌酒停酒打擊存活組大鼠各腦區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均顯著多于各急性組(P<0.05)；慢性單純灌酒組和慢性灌酒打擊死亡組各腦區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均多于各急性單純灌酒和急性單純灌水組(P<0.05)，與急性灌酒打擊組和灌水打擊組無(wú)顯著差異(P>0.05)。
　　 3.2 S-100β蛋白IOD 值
　　 急性灌酒打擊組和灌水打

14、擊組各腦區(qū)S-100βIOD 值均高于急性單純灌酒組和急性單純灌水組(P<0.05)，打擊組之間、單純組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。慢性單純灌酒組的IOD 值最高，均顯著高于其它慢性灌酒組（P<0.05)；慢性灌酒打擊死亡組的IOD 值最低，均顯著低于其它慢性灌酒組(P<0.05)；慢性灌酒打擊存活組與慢性灌酒停酒打擊存活組的IOD 值無(wú)顯著差異(P>0.05)。
　　 除慢性灌酒打擊死亡組以外，其它慢性灌酒組的IOD 值

15、均高于急性組；慢性灌酒打擊死亡組的IOD 值與急性灌酒打擊和灌水打擊組無(wú)顯著差異(P>0.05)，高于急性灌酒和急性單純灌水組(P<0.05)。
　　 3.3 MBPIOD 值
　　 急性灌酒打擊組和急性灌水打擊組腦干和胼胝體MBpIOD 值均顯著低于單純灌酒和單純灌水組（P<0.05)，打擊組之間、單純組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；小腦各組間均無(wú)顯著差異(P>0.05)。
　　 慢性單純灌酒組各腦區(qū)MBp

16、IOD 值最高，高于其它各慢性灌酒打擊組(P<0.05)；各慢性灌酒打擊組之間胼胝體及小腦MBpIOD 值無(wú)顯著差異(P>0.05)；慢性灌酒打擊死亡組腦干MBpIOD 值高于慢性灌酒打擊存活組及慢性灌酒停酒打擊存活組(P<0.05)，存活組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。除慢性單純灌酒組與急性打擊組大鼠各腦區(qū)MBpIOD 值無(wú)顯著差異外(P>0.05)，慢性灌酒組各腦區(qū)MBPIOD 值均低于急性組（P<0.05)。
　　 結(jié)論