利用植物生物反應(yīng)器制備白藜蘆醇的相關(guān)研究.pdf

1、植物生物反應(yīng)器是指通過基因工程途徑，將常見的農(nóng)作物進(jìn)行大規(guī)模種植從而生產(chǎn)具有高經(jīng)濟(jì)附加值的醫(yī)用蛋白、工農(nóng)業(yè)用酶、脂類及其它一些次生代謝產(chǎn)物等生物制劑。具有經(jīng)濟(jì)、高效、安全的特點，其應(yīng)用能夠滿足科研及人們?nèi)找嬖鲩L的健康、保健的需求。 白藜蘆醇(Resveratrol，簡稱Res)是一種含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚化合物。它不僅是植物遭受脅迫時產(chǎn)生的一種植物抗毒素，還具有抗癌、抗氧化、調(diào)節(jié)血脂，影響壽命等多方面有益于人類健康的重要功能

2、。自然的條件下Res在植物體內(nèi)的含量非常低，且用傳統(tǒng)的提取方法獲得高豐度的Res非常困難。白藜蘆醇合酶(Resveratrol synthase，簡稱RS)是Res合成途徑中最后一個起作用的關(guān)鍵酶，也是唯一必須的合成酶。本實驗通過分子生物學(xué)手段，分離得到花生白藜蘆醇合酶基因(PNRS1)的基因組DNA和cDNA，通過構(gòu)建不同的表達(dá)載體，分別對大腸桿菌和植物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，已經(jīng)取得了如下進(jìn)展： 利用RT—PCR技術(shù)從花生根部cDNA

3、中擴(kuò)增出PNRS1基因的cDNA(登陸號：FM955393)，然后將其重組到克隆載體中。通過測序并進(jìn)行序列比對證明，所獲得的PNRS1基因與登陸號為AY170734的序列同源性達(dá)到95％。其編碼的氨基酸序列與登陸號為AAO11837的氨基酸序列同源性達(dá)到96％，且序列中包含有RS的特征結(jié)構(gòu)及活力位點，成功獲得了花生PNRS1基因的cDNA。RT—PCR分析表明，PNRS1在花生根中特異表達(dá)，并可被紫外誘導(dǎo)表達(dá)。 將測序正確的PN

4、RS1基因與原核表達(dá)載體pET—28a融合獲得讀框正確的表達(dá)載體pET—28a—PNRS1。該載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后PNRS1能夠正確表達(dá)，融合蛋白分子量約為46KD，與預(yù)期相符，且最適IPTG誘導(dǎo)濃度為Immol/L，最佳誘導(dǎo)時間為3h。證明實驗中成功構(gòu)建了花生RS的原核表達(dá)載體，優(yōu)化了RS高效表達(dá)體系，為進(jìn)一步深入研究花生RS的功能打下了基礎(chǔ)。 同時，將測序正確的花生RScDNA基因分別正向、反向插入到植

5、物表達(dá)載體pBI121和修飾過的pCAMBIA1301的CaMV35s啟動子和NOS終止子之間，成功獲得植物表達(dá)載體pBRS和p1301—35s—RS1。經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入煙草，獲得了若干轉(zhuǎn)基因植株。利用紫外分光光度法及HPLC對部分轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了白藜蘆醇含量測定，證明白藜蘆醇含量較對照植株均有提高。 本實驗在傳統(tǒng)育種的基礎(chǔ)上，通過基因工程手段，獲得了花生RS基因并將其導(dǎo)入植物中，得到了Res含量變化及抗環(huán)境惡化能力提高的株系，