STK33及NGFR在頭頸鱗狀細胞癌中的作用及機制研究.pdf

1、本文從以下幾個部分展開論述:
　　第一部分 STK33促進下咽癌增殖與鈣離子相關性研究
　　目的:本文旨在在前期研究的基礎上，進一步通過體內(nèi)實驗和Mi croarray分析來探索STK33的功能，重點探索STK33的改變與鈣離子的可能關系。
　　方法:通過含有針對STK33的shRNA的慢病毒載體，感染細胞，并使用PCR法檢測慢病毒感染后Fadu細胞中STK33 mRNA表達的變化。進行Microarray分析，尋找S

2、TK33基因敲除后的表達譜變化。注射Fadu細胞，Mock空載體細胞，以及STK33基因敲除細胞于5周雄性裸鼠右側腋下進行皮下注射，定期測量腫瘤大小，并計算腫瘤體積，待對照組的腫瘤直徑達到1.5厘米時，收獲腫瘤和肺組織。在進行蘇木素伊紅染色后，使用顯微鏡觀察腫瘤和肺的形態(tài)學改變，以了解Fadu細胞在體內(nèi)成瘤和侵襲轉移的能力。進行免疫組化分析STK33蛋白的表達。使用MTT和吖啶橙染色檢測Ionomycin對Fadu細胞存活力及形態(tài)學改變

3、的影響。通過使用Fluo-3/AM染色，借助共聚焦顯微鏡對細胞內(nèi)鈣離子的濃度進行檢測。使用實時熒光定量PCR及western blot檢測相關基因的mRNA及蛋白的表達情況。
　　結果:STK33-RNAi穩(wěn)定表達的Fadu細胞，感染空載體的Fadu細胞和對照Fadu細胞皮下注射到雄性裸鼠右側腋下后第14天對照Fadu細胞成瘤，共生長39天。空載體對照組和對照Fadu細胞組表現(xiàn)出相似的生長率，在第39天時，體積達到約570mm3。

4、然而，穩(wěn)定轉染的STK33-RNAi表達的Fadu細胞在裸鼠體內(nèi)生長緩慢，在39天僅形成較小的腫瘤，體積約為90mm3。在STK33表達和不表達的細胞中腫瘤的體積有顯著差異。這表明STK33促進HSCC在體內(nèi)的形成。免疫組化結果顯示STK33在STK33-RNAi細胞中的表達比載體對照組的細胞弱。注射對照組細胞的裸鼠的肺顯示存在轉移;相反，在注射STK33-RNAi細胞的裸鼠中未見轉移。
　　通過Microarray分析，在STK

5、33-RNAi細胞中，我們發(fā)現(xiàn)了140個有顯著差異的標記基因。這些基因顯著（p＜0.05）上調(diào)(n=86)或者下調(diào)(n=54)。通過通路分析，我們發(fā)現(xiàn)STK33影響很多基因的表達，調(diào)節(jié)很多通路。從中我們發(fā)現(xiàn)了Calpainl(CAPN1)，并用qRT-PCR確認CAPN1的mRNA表達水平。在STK33-RNAi Fadu細胞中CAPN1的表達顯著下降（p＜0.05）。
　　Ionomycin可以迅速升高細胞內(nèi)鈣離子的濃度。在1.

6、5μ M的Ionomycin作用6小時后進行吖啶橙染色發(fā)現(xiàn)未處理的細胞呈現(xiàn)多邊形，然而，典型的凋亡特點出現(xiàn)在Ionomycin處理的細胞中，包括細胞形態(tài)不規(guī)則，細胞皺縮，染色質凝集，染色小體出現(xiàn)，表明Ionomycin可以誘導Fadu細胞凋亡。細胞存活率在Fadu細胞中顯示出明顯的隨Ionomycin作用時間延長而降低的趨勢。表明Ionomycin抑制細胞存活率呈現(xiàn)時間依賴性。在STK33-RNAi作用后細胞存活率顯著下降。此外，在ST

7、K33-RNAi與Ionomycin同時作用后，細胞存活率下降程度低于僅Ionomycin作用（p＜0.05）。與未處理的Fadu細胞相比，STK33的蛋白表達在1.5μ M Ionomycin作用1，2，4，6小時后升高。統(tǒng)計分析表明STK33的蛋白表達在作用1，2，4，6小時后比對照組顯著升高(p＜0.05)。這表明，Ionomycin可以增高STK33蛋白的表達。Fadu細胞中的CAPN1在1.5μM Ionomycin作用1，2

8、，4，6及24小時后CAPN1顯著升高(p＜0.05)。但在STK33-RNAi組中，作用前后沒有顯著性差異。
　　結論:shRNA介導的STK33基因的敲除抑制Fadu細胞在體內(nèi)的成瘤能力，從而證明STK33本身對腫瘤生長的促進作用。表明STK33在腫瘤形成中發(fā)揮重要作用。此外，通過免疫組化發(fā)現(xiàn)STK33在STK33-RNAi組所成腫瘤中的表達明顯下降。這表明STK33-RNAi仍然發(fā)揮它對STK33的敲除作用，藉以表明Fadu

9、細胞在以STK33-RNAi抗腫瘤影響的基礎上的增值能力的降低?？傊?，體內(nèi)實驗進一步證實了我們前期的從體外及臨床切除樣本中得到的STK33是一個潛在癌基因的研究結果。STK33基因通過多種信號通路在Fadu細胞中發(fā)揮作用。這個過程中包含大量決定腫瘤進展中的重要功能的基因。CAPN1，在STK33-RNAi的干擾下顯著下調(diào)，正如本研究中進一步PCR所證明的。本研究表明CAPN1的活性受STK33-RNAi的影響，提示CAPN1涉及STK3

10、3在Fadu細胞中誘導腫瘤形成的作用。這個發(fā)現(xiàn)可能是一個很有吸引力的線索，在Fadu細胞中，STK33可能與鈣離子有關。因為STK33屬于CAMK家族。這促使我們關注STK33活性與Ionomycin作用后Fadu細胞內(nèi)鈣離子改變的關系。Ionomycin可以在體外抑制Fadu細胞的生長。這表明Ionomycin通過提高細胞內(nèi)鈣離子濃度來表現(xiàn)出它對Fadu細胞的毒性作用。有意思的是，STK33-RNAi可以在一定程度上抵消Ionomyc

11、in引起的細胞損傷。表明STK33敲除可能保護細胞不受Ionomycin觸發(fā)的高細胞內(nèi)鈣離子濃度而引起的細胞損傷。這為細胞內(nèi)游離鈣離子可能通過STK33活性來影響CAPN1表達，從而影響一些與STK33在腫瘤發(fā)生中重要作用相關的重要的信號轉導通路，提供了證據(jù)。
　　總之，本研究進一步證明了STK33是一個潛在的癌基因，它通過調(diào)節(jié)眾多基因在HSCC腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用。另外，在Fadu細胞內(nèi)的STK33和鈣離子存在相互的影響。

12、r>　　第二部分 NGFR在ESM1介導的口腔鱗狀細胞癌腫瘤發(fā)生中的作用研究
　　目的:本研究在我們前期研究的基礎上，設計通過小鼠OSCC細胞的Mi croarray分析和體內(nèi)外實驗來進一步探索NGFR的功能。
　　方法:使用實時熒光定量PCR、流式細胞術及ELISA實驗檢測相關基因的mRNA和蛋白的表達情況。通過慢病毒感染細胞，穩(wěn)定過表達MOC2細胞中的NGFR(MOC2T)，進行Microarray分析，尋找NGFR基因

13、過表達后的表達譜變化。通過慢病毒感染細胞，穩(wěn)定過表達MOC2細胞中的ESM1，敲除ESM1在MOC2和MOC2T細胞中的表達。使用MTT和Transwell侵襲轉移實驗分析ESM1和NGFR對細胞增殖和侵襲轉移能力的影響。注射MOC2，MOC2-7，MOC2-10，MOC2-ESM1-SH，MOC2T和MOC2T-ESM1-SH細胞于6-11周B10; B6-Rag2-/-II2rg-/-小鼠右側后腿背側進行皮下注射，定期測量腫瘤大小，

14、并計算腫瘤體積，收獲腫瘤和肺組織。在進行蘇木素伊紅染色后，使用顯微鏡觀察腫瘤和肺的形態(tài)學改變。檢測ESM1是否參與血管形成，進行免疫熒光分析血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達。
　　結果:通過qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，NGFR在小鼠OSCC細胞系(MOC2，MOC2-7和MOC2-10)中表達。通過慢病毒感染，形成NGFR穩(wěn)定過表達的MOC2細胞株，通過Micro

15、array分析尋找NGFR過表達后的基因表達譜改變。通過對Mi croarray結果的分析，我們發(fā)現(xiàn)了內(nèi)皮細胞特異性分子-1(endothelial cell specific molecule1，ESM1)。ESM1是一種新型的內(nèi)皮衍生的水溶性硫酸皮膚蛋白多糖，具有廣泛結合與細胞信號和粘附相關的生物活性分子的能力，從而調(diào)節(jié)健康和疾病中的不同類型細胞的增殖，分化，轉移和粘附。NGFR依賴的ESM1的mRNA水平的表達在NGFR過表達和N

16、GF處理的細胞中得到驗證。ESM1的表達水平與小鼠OSCC細胞系的增殖和侵襲轉移能力成正相關。ESM1過表達誘導MOC2細胞活力，遷移和侵襲能力。相反，ESM1的敲除抑制MOC2細胞的增殖，遷移和侵襲能力。免疫缺陷小鼠皮下移植瘤表明ESM1的敲除減小腫瘤大小和肺轉移的克隆數(shù)目。降低NGFR過表達的MOC2細胞(MOC2T)的ESM1的表達也可以在體內(nèi)及體外降低MOC2T腫瘤增殖以及侵襲和轉移能力。
　　總之，這是第一次報告ESM1