活化性T淋巴細胞核因子5在煙霧吸入性急性肺損傷中的作用研究.pdf

1、據(jù)統(tǒng)計，約5％～10％燒傷患者并發(fā)吸入性肺損傷，重度死亡率可達80％以上，是早期燒傷患者主要的死因之一。雖然針對吸入性損傷的研究一直是國內(nèi)外研究的熱點，但其關鍵因素始終未能得到突破性進展，從而導致其死亡率居高不下。因此，對肺損傷的確切發(fā)病機制及有效的主動性干預措施的研究實屬必要。
　　研究發(fā)現(xiàn)，在急性肺損傷的發(fā)病機制中核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)有著重要作用。特異性抑制NF-κB信號通路的

2、活化可減少炎癥的級聯(lián)放大，控制吸入性損傷的病變程度及減緩疾病進程。然而，由于NF-κB作用的時間和空間上的特異性，NF-κB信號通路的抑制劑尚未取得成功。微小RNA(microRNAs，miRNAs)技術的出現(xiàn)，為這一難題的解決提供了可能。
　　miRNAs是具有調(diào)節(jié)作用小分子非編碼RNA，能夠與靶mRNA的3'非編碼區(qū)特異性結合，介導翻譯抑制或誘導降解，發(fā)揮轉錄后水平調(diào)控。miRNAs在抑制腫瘤細胞生長以及免疫方面的作用已經(jīng)引起

3、廣泛關注，然而，關于miRNAs在煙霧吸入性急性肺損傷的相關功能研究鮮有報道。miR-155是miRNAs重要一員，在免疫及炎癥方面具有重要的作用，但在煙霧吸入性急性肺損傷研究尚未見報道。
　　活化性T淋巴細胞核因子5(nuclear factor of the activated T cell5，NFAT5)屬于Rel家族蛋白，因參與滲透壓的調(diào)節(jié)而被大家所了解。此外，NFAT5還可誘導促炎因子的表達，促進炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展。因此

4、，我們猜測既然炎癥發(fā)生、發(fā)展與煙霧吸入性急性肺損傷有關，那么NFAT5是否也與煙霧吸入性急性肺損傷的發(fā)病機制有關？其相關研究國內(nèi)外尚未報道。
　　目的：
　　本實驗采用大鼠煙霧吸入性急性肺損傷模型，在基因及分子水平對煙霧吸入性急性肺損傷的發(fā)病機制進行研究，探究:①NFAT5是否參與了煙霧吸入性肺損傷？②NFAT5功能的調(diào)控因子miR-155的篩選及功能驗證。③NFAT5在煙霧吸入性急性肺損傷發(fā)病機制的作用。我們首先建立煙霧吸

5、入性急性肺損傷大鼠動物模型，并通過miRNA芯片檢測和表達譜芯片檢測尋找出差異性表達的miRNAs和基因(miR-155和NFAT5)。通過體內(nèi)及體外實驗正反兩方面研究NFAT5在煙霧吸入性急性肺損傷中的功能研究。
　　方法:
　　1、煙霧吸入性急性肺損傷大鼠動物模型建立:使用自制煙霧吸入性損傷儀，建立大鼠煙霧吸入性急性肺損傷模型，通過肺組織HE染色、肺組織濕干比及COX2的Western blot進行驗證;
　　2、

6、miR-155、NFAT5的篩選及相關分析:選煙霧致傷和正常大鼠各3只，煙霧致傷24小時后，對肺組織進行microRNA芯片檢測和表達譜芯片檢測（miRNA4.0芯片數(shù)據(jù)及RTA芯片數(shù)據(jù)），篩選出差異表達明顯的miRNA及對應的靶基因;
　　3、細胞水平對miR-155與NFAT5靶向關系的研究:利用生物信息學方法預測其靶基因;采用基因工程手段構建靶基因-熒光素酶報告質(zhì)粒，并通過雙熒光素酶實驗鑒定miRNA與靶基因mRNA3'-U

7、TR是否互補結合;
　　4、miR-155功能的研究:將大鼠分為A:正常對照組:煙霧吸入性損傷組+安慰劑（生理鹽水）、B:煙霧吸入性損傷組+miRNA-155control、C:煙霧吸入性損傷組+miRNA-155mimics、D:煙霧吸入性損傷組+miRNA-155inhibitors，轉導治療24小時后，通過病理HE染色、酶聯(lián)免疫分析(ELISA)(炎癥因子(Tumor Necrosis Factor-alpha(TNF-α)

8、、monocyte chemotactic peptide-1(MCP-1)、(Interleukin-IL)-1β、IL-8)）、實時定量PCR(Real time PCR，RT-PCR)（TNF-α、IL-1β）、COX2的Western blot等方法研究miR-155是否能夠減輕肺損傷及降低肺組織炎性分子的表達;
　　5、NFAT5在煙霧吸入性肺損傷中的實驗研究:對煙霧致傷組和正常對照組大鼠，行Western blot和R

9、T-PCR檢測NFAT5的表達情況;并對轉導治療中各分組行Western blot檢測NFAT5、P-P65、P65、COX2的表達情況;最后對基因敲除小鼠和正常小鼠煙霧致傷后24小時，行病理HE染色和Western blot檢測NFAT5、P-P65和COX2，進一步驗證靶基因及相關通路蛋白在煙霧吸入性肺損傷中作用。
　　結果:
　　1、成功建立大鼠煙霧吸入性急性肺損傷動物模型:病理結果顯示煙霧致傷組明顯的炎細胞浸潤、充血

10、及肺泡改變;肺濕干比及COX2的灰度值均顯示煙霧致傷組大于正常組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);
　　2、miR-155、NFAT5參與煙霧吸入性急性肺損傷，且miR-155對NFAT5具有靶向調(diào)控趨勢:
　　miRNA芯片篩選得到了47個差異表達的miRNA具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，表達上調(diào)和下調(diào)的分別為24和23個，超過2倍顯著差異表達的miRNAs包括:表達上調(diào)的miR-449a-5p、miR-205、mi

11、R-155-5p和表達下調(diào)的miR-92b-5p、miR-667-5p、miR-708-5p。上調(diào)的miRNAs中miR-155表達明顯上調(diào)3.46倍;RTA芯片檢測篩選得到共有30種基因差異表達具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，表達上調(diào)的有AKR1B10、CXCL13、VSIG4和表達下調(diào)的PLP2、SCD1、NFAT5、ATP6VB2等，且miRNA芯片和RTA芯片聯(lián)合分析結果顯示miR-155對NFAT5具有靶向調(diào)控趨勢;
　

12、　3、miR-155對NFAT5基因mRNA3'-UTR具有靶向調(diào)控作用:
　　Mirbase、TargetS can、PicTar預測交叉結果顯示，NFAT5基因3'UTR與miR-155存在結合互補位點;構建pMIR-NFAT5、pMIR-NFAT5-mu重組質(zhì)粒經(jīng)酶切及測序鑒定正確;雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)顯示:pMIR-NFAT5+miR155mimics組較pMIR-NFAT5+miR-control組熒光素酶活性降低

13、，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);
　　4、miR-155能減弱煙霧致傷大鼠的肺損傷和全身炎癥反應:
　　病理檢測結果顯示煙霧吸入性損傷組+miRNA-155mimics大鼠肺組織的炎癥充血、炎癥細胞的浸潤及肺泡結構破環(huán)程度較煙霧吸入性損傷組+miRNA-155control和煙霧吸入性損傷組+miRNA-155inhibitors明顯弱，僅次于正常對照組;ELISA、Western blot、RT-PCR等證實了過表達

14、miR-155可以減弱煙霧導致急性肺損傷相關蛋白COX2和炎癥因子(TNF-α、MCP-1、IL-1β、IL-8)的表達(P＜0.05)。
　　5、NFAT5加重煙霧吸入性急性肺損傷:
　　Western blot和RT-PCR檢測煙霧致傷組和正常對照組大鼠NAFT5結果顯示煙霧致傷組的高于正常對照組，差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01);煙霧吸入性損傷組+miRNA-155control、煙霧吸入性損傷組+miRNA-1

15、55mimics、煙霧吸入性損傷組+miRNA-155inhibitors三組大鼠肺組織標本W(wǎng)estern Blot結果示煙霧吸入性損傷組+miRNA-155mimics大鼠肺組織NFAT5、P-P65、P65、COX2四種蛋白表達明顯低于煙霧吸入性損傷組+miRNA-155control和煙霧吸入性損傷組+miRNA-155inhibitors;NFAT5基因敲除小鼠和正常小鼠煙霧致傷后24小后，病理檢測顯示NFAT5-KO小鼠較正常