長(zhǎng)型NFE2L1在急性砷暴露所致MIN6胰島β細(xì)胞損傷中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:砷是一種環(huán)境氧化應(yīng)激物，長(zhǎng)期暴露可以導(dǎo)致皮膚色素沉著、皮膚角化，還可能誘發(fā)多種惡性腫瘤，大量流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境砷暴露與2型糖尿病發(fā)生密切相關(guān)。由于2型糖尿病可以歸因于胰島素分泌缺陷和胰島素抵抗的共同作用，因此研究胰島β細(xì)胞的功能在闡明砷致糖尿病的病理機(jī)制中至關(guān)重要。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(Nuclear factor-related factor2，NFE2L2)介導(dǎo)的適應(yīng)性抗氧化反應(yīng)在砷導(dǎo)致胰島β細(xì)胞

2、急性損傷過(guò)程中起到了重要保護(hù)作用;轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子1(Nuclear factor-related factor1，NFE2L1)參與調(diào)控胰島β細(xì)胞葡萄糖刺激胰島素分泌過(guò)程;急性砷暴露可以激活長(zhǎng)型NFE2L1。但是長(zhǎng)型NFE2L1在砷致胰島β細(xì)胞損傷的作用尚無(wú)研究報(bào)導(dǎo)，本研究旨在探討長(zhǎng)型NFE2L1在急性砷暴露導(dǎo)致的胰島β細(xì)胞損傷中的作用及機(jī)制。
　　研究方法:
　　1、首先利用含有shRNA的慢病毒對(duì)MIN6細(xì)胞

3、進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，建立穩(wěn)轉(zhuǎn)Scramble和Nfe2l1(L)-KD MIN6細(xì)胞。
　　2、對(duì)Scramble和Nfe2l1(L)-KD MIN6細(xì)胞進(jìn)行急性砷處理后，利用MTS和臺(tái)盼藍(lán)染色方法檢測(cè)細(xì)胞活力。
　　3、利用Western Blot技術(shù)檢測(cè)蛋白表達(dá)，包含凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-Caspase-3和Cleaved-PARP以及NFE2L1、NFE2L2水平等。
　　4、利用Real-time qPCR技術(shù)對(duì)抗

4、氧化及Ⅱ相解毒酶基因表達(dá)進(jìn)行定量分析。
　　5、利用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS水平。
　　6、利用超低溫冷阱捕集-氫化物發(fā)生-原子吸收分光光度法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的iAs、一甲基胂(Monomethylarsenic，MMA)和二甲基胂(Dimethylarsenic，DMA)等砷化物的含量。
　　7、通過(guò)Real-time qPCR技術(shù)篩選相關(guān)microRNA，利用microRNA類似物轉(zhuǎn)染Scramble和Nfe2l1(L

5、)-KD MIN6細(xì)胞。利用臺(tái)盼藍(lán)染色和Western Blot技術(shù)對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-Caspase-3及Cleaved-PARP進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)microRNA功能進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:
　　1、通過(guò)對(duì)Scramble和Nfe2l1(L)-KD MIN6細(xì)胞中NFE2L1進(jìn)行檢測(cè)，確認(rèn)長(zhǎng)型Nfe2l1在MIN6細(xì)胞中被有效沉默。
　　2、MTS檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在MIN6細(xì)胞中，急性砷處理后Nfe2l1(L)-K

6、D細(xì)胞活力降低，而臺(tái)盼藍(lán)染色后計(jì)數(shù)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)在Nfe2l1(L)-KD細(xì)胞中死細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組，凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-Caspase-3及Cleaved-PARP的表達(dá)量也明顯增多。上述結(jié)果表明，長(zhǎng)型Nfe2l1缺失會(huì)導(dǎo)致MIN6細(xì)胞對(duì)急性砷暴露所引起的細(xì)胞毒性更敏感。
　　3、在MIN6細(xì)胞中，抗氧化基因Gclc、Gclm和Ho-1的mRNA水平以及活性氧ROS在Scramble和Nfe2l1(L)-KD細(xì)胞中無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)

7、學(xué)差異，因此無(wú)法從抗氧化角度解釋Nfe2l1(L)-KD對(duì)急性砷暴露敏感性增多的現(xiàn)象。而Ⅱ相解毒酶Gsto1、Gstm1和Nqo1的表達(dá)水平在Nfe2l1(L)-KD細(xì)胞中明顯高于Scramble，提示細(xì)胞內(nèi)代償機(jī)制被激活。
　　4、急性砷處理后，Nfe2l1(L)-KD MIN6細(xì)胞中NFE2L2蛋白水平增加，這可能是導(dǎo)致上述ARE基因表達(dá)差異的原因之一。
　　5、急性砷暴露后Nfe2l1(L)-KD細(xì)胞中MMA和甲基化率

8、均顯著高于Scramble。
　　6、通過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)，既受砷暴露影響，又受長(zhǎng)型NFE2L1調(diào)控，且與胰島β細(xì)胞相關(guān)的microRNA是miR-184。將miR-184類似物轉(zhuǎn)染進(jìn)入MIN6細(xì)胞后，進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色和凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè)，初步研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-184類似物對(duì)細(xì)胞損傷水平?jīng)]有顯著影響。
　　結(jié)論:
　　1、長(zhǎng)型Nfe2l1沉默導(dǎo)致MIN6細(xì)胞對(duì)急性砷毒性更敏感，其損傷機(jī)制可能是Nfe2l1(L)-KD細(xì)胞中NFE