2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  心肌梗塞引起心肌細胞壞死,纖維組織增生,瘢痕形成,心臟擴大,收縮力減低,最終導致心衰。雖然近年來心梗的藥物治療(抗血小板藥物,ACEI類藥物,調脂類藥物)及侵入性治療(PCI及CABG)取得了顯著進展,但是心梗后心衰的死亡率和發(fā)病率仍然居高不下。原因在于目前的治療措施僅能夠暫時延緩疾病的進展,未得到及時再灌注的心?;颊叩男募≡诮酉聛頃霈F(xiàn)較大的瘢痕組織以及嚴重的左室功能不全。鑒于上述情況,急需新的能夠再生梗塞心肌,修復

2、心梗后心臟的治療措施出現(xiàn),從而逆轉心衰患者的不良預后。
  心臟組織工程及生物材料工程主要基于應用人工合成的或天然生物基質材料構建可收縮的類心肌組織從而逆轉心衰的進展。鑒于可注入型天然生物材料可通過微創(chuàng)形式注入體內,因而成為目前研究的熱點1。Wangde Dai等人2通過研究已經證實向大鼠心梗心肌內注入心肌組織源性的脫細胞化細胞外基質(ECM)能夠增加心梗后的左室壁厚度,防止左室矛盾性收縮膨出,改善心梗后的左室射血分數(shù)(LVEF)

3、。并且這種治療益處并不依賴于局部血管生成增多或者募集內源性干細胞向心肌損失部位遷徙。
  CDCs(心肌球源性心肌干細胞)是一種富集心肌祖細胞和支持細胞的心肌源性干細胞。這種細胞能夠自我更新并且無論在體還是離體,均能夠向心肌細胞和血管細胞分化3。它們能夠促進心梗小鼠的心肌細胞再生并且改善心功能4。無免疫抑制措施移植同種異體CDCs治療大鼠心梗是安全有效的,能夠促進心肌再生,從而改善心臟功能。這項研究結果鼓舞人們進一步將人類的同種異

4、體CDCs作為一種潛在的現(xiàn)成的細胞心肌成型產品5。Malliaras K等人通過研究證實,與安慰劑組比較,向Yucatan迷你豬心梗心肌組織內移植同種異體CDCs治療心梗,能夠減輕左室重構,改善心肌整體和局部功能,降低心梗瘢痕面積,并且還能夠增加存活心肌組織量6。還有研究證實源于重度心衰病人心肌的CDCs具有較強的改善心梗后左室功能不全的潛能,其可能機制為通過SDF-1介導7。
  然而,移植到宿主心肌內干細胞的定植率和長期存活率

5、非常有限。其機制可能為移植到宿主心肌內的干細胞通過血液沖刷和心肌擠壓而丟失8,9。可注入型天然生物材料可用作移植干細胞載體從而增加移植干細胞的定植率和存活率10,11,12。還有研究表明直接直接心肌內注入途徑的干細胞較經冠脈途徑注入的干細胞定植率存活率要高13。因此我們擬采用直接心肌內干細胞注入途徑移植干細胞。
  基于上述討論的臨床前期研究經驗,且考慮到自體干細胞移植所取得的的令人鼓舞的研究結果14,15,已經有基于同種異體心肌

6、源性干細胞治療急性心梗的兩項臨床研究正在進行(ALLSTAR,CAREMI)。且源于同種異體心肌干細胞的初期研究結果令人鼓舞。
  雖然單獨應用同種異體CDCs的治療結果令人鼓舞,我們在考慮將CDCs聯(lián)合天然生物材料能夠增加CDCs的治療價值。在目前的研究中,我們擬研究在大鼠心梗模型中,CDCs聯(lián)合心肌組織源性的ECM是否能夠促進離體和在體CDCs的增殖,分化;是否能夠增加心梗左室壁厚度,改善左室功能以及提高移植入大鼠心肌內CDC

7、s的定植率以及遠期存活率。從而為今后心梗及心衰的臨床治療提供理論依據(jù)。
  方法:
  一、CDC體外培養(yǎng)及生長分化的觀察研究及心肌細胞外基質(ECM)的制備及檢測
  由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供的實驗用清潔級雄性Wistar大鼠(體重170-180g)心臟,培養(yǎng)CDC。即采用心肌組織塊培養(yǎng)法,采用CEM培養(yǎng)液培養(yǎng)原代細胞(EDC);原代細胞平鋪于PDL包被的12孔培養(yǎng)板上,平鋪密度為40000-50000/孔,采

8、用CGM培養(yǎng)液培養(yǎng)出“心肌球”(CS);采集“心肌球”,12孔培養(yǎng)板上每3個孔所搜集的“心肌球”平鋪于1個60mm FN包被的培養(yǎng)皿上,CEM培養(yǎng)液培養(yǎng);“心肌球”平鋪5-7天后,采集CDC,用于凋亡及下一步細胞移植實驗,平鋪生長14天的CDC用于熒光鑒定其分化。對比常規(guī)FN包被的培養(yǎng)皿及ECM+FN包被的培養(yǎng)皿所培養(yǎng)的CDC凋亡率;CDC生長14天后,免疫熒光鑒定CDC分化情況,對比常規(guī)FN包被的培養(yǎng)皿及ECM+FN包被的培養(yǎng)皿所培養(yǎng)

9、的CDCα-SA,α-SMA,v-WF表達情況及表達率;MTT法對比常規(guī)FN包被的培養(yǎng)皿及ECM+FN包被的培養(yǎng)皿所培養(yǎng)的CDC的生長曲線,時間點分別為12h,1d,3d,7d,14d.
  實驗用清潔級雌性Wistar大鼠若干用于制備ECM,體重210±1.32g,由中國醫(yī)科大學實驗動物部中心提供。Wistar大鼠(雌性,體重約200克)10%水合氯醛麻醉后取其心臟,清除脂肪組織,用無菌眼科剪刀將其箭成厚度約1-mm組織碎片。將

10、剪好的組織片置于50 mL無菌離心管中并浸入無菌D-PBS溶液中洗滌,后浸入無菌3.4 mol/L NaCl溶液中,用組織粉碎機(IKA,Wilmington,NorthCarolina)將組織碎片做成勻漿懸液,4℃搖床搖勻(130rpm)30分鐘。3000rpm室溫離心10分鐘,去上清。加入50 units/mL DNAse and10 mg/mL of RNAse的無菌PBS溶液中,4℃搖床搖勻(130rpm)1小時,以便充分去除所

11、有核酸物質。3000rpm室溫離心10分鐘,去上清。更換1% TritonⅩ-100溶液,4℃搖床搖勻(130rpm)1小時。3000rpm室溫離心10分鐘,去上清。更換無菌PBS溶液,4℃搖床搖勻(130rpm)1小時。3000rpm室溫離心10分鐘,去上清。重復8,9過程2次,將得到的ECM置于-80℃保存?zhèn)溆谩sw重200克左右的大鼠心臟可制備10毫克的ECM.I型鼠尾膠原膠(3.75mg/ml)3ml+10×MEM1 ml+nuc

12、lease free無菌水6ml,配置成10ml濃度為1mg/ml的一型鼠尾膠原膠溶液,向10ml濃度為1mg/ml的一型鼠尾膠原膠溶液中加入幾滴(大概2.5滴)1N NaOH溶液(無菌)震蕩搖勻,可見溶液顏色由黃變紅。將10mgECM粉末加入其中,制備成1mg/ml的ECM溶液,可應用于心肌內注射。HE染色檢測ECM中是否有細胞成分殘余。
  二、CDC聯(lián)合心室肌細胞外基質治療大鼠急性心梗的效果研究及
  通過熒光定量PC

13、R檢測雄性大鼠sry基因片段半定量比較移植CDC的定植和存活
  實驗清潔級雌性Wistar大鼠48只,E組,EC組,I組,IC組各12只,用于造心梗模型及接受雄性Wistar CDC細胞,體重210g左右,由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供。
  10%水合氯醛麻醉大鼠,氣管切開直視下插管,接小動物呼吸機,胸骨左緣2,3肋間入胸,結扎左前降支近中段,制造大鼠心梗模型,分四組28-gauge注射器于心梗交界4點注射法于梗塞區(qū)域內

14、心肌內:150ul IMDM(Gibco)(對照組I組,n=12),150ul空白ECM懸液(空白組E組,n=12),150ulECM懸液包含1×106CDCs(EC組,n=12),150ul IMDM(Gibco)包含1×106CDCs(IC組,n=12),小動物心臟彩超測量各組大鼠心梗前,心梗后6h及心梗后3W各組間IVS,LVEF,EDV,ESV,F(xiàn)S%,LVIDd,LVIDds,然后處死大鼠,取材心臟。10%福爾馬林固定。常規(guī)石

15、蠟包埋,切片,行Masson染色。定量對比分析心梗纖維化面積百分比及積分OD值。免疫熒光法檢測各組心梗后1周和心梗后3周心梗周邊心肌組織切片表達α-SA,α-SMA,v-WF及c-kit表達;定量對比分析陽性面積百分比及積分OD值。采用WB法檢測各組心梗后3周α-SA,α-SMA,v-WF及c-kit表達,并定量對比分析,選用β-actin做內參。
  由中國醫(yī)科大學動物中心提供實驗用清潔級雌性Wistar大鼠36只,體重200-

16、210g,EC組,IC組各12只,對照組雌性大鼠僅接受心梗造模無CDC移植,接受雄性Wistar CDC細胞,分別于心梗后24小時及3W通過熒光定量PCR檢測雌性大鼠心肌內雄性Wistar大鼠sry基因片段,從而對比兩組(EC組,IC組)在急性心梗移植CDC后24小時和3周的干細胞在心肌組織內定植及存活情況(2-△△CT法)。
  結果:
  一、CDC體外培養(yǎng)及生長分化的觀察研究及心肌細胞外基質(ECM)的制備及檢測

17、>  心肌組織塊平鋪FN包被的培養(yǎng)皿3-5天后,從心肌組織塊中生長出EDC,包括纖維細胞樣和在倒置顯微鏡下觀察為小圓亮2種形態(tài)細胞。CDC平鋪于PDL包被的12孔培養(yǎng)板后5-7天可生長出一代心肌球,采集一代心肌球平鋪于FN包被的60mm培養(yǎng)皿后3-5天生長出CDC。體外免疫熒光檢測提示心肌球中心部為大量表達c-kit的細胞,心肌球平鋪后的CDC也表達c-kit。體外熒光鑒定提示ECM包被的培養(yǎng)皿內生長的CDCα-SA,α-SMA,v-W

18、F表達率較常規(guī)FN包被的培養(yǎng)皿內生長的CDC的表達率顯著增高,且ECM包被的培養(yǎng)皿內生長的CDC具有較高的增殖活力以及較低的凋亡率,差異具有統(tǒng)計學意義。
  本實驗中所應用心肌細胞外基質(ECM)的制備方法可徹底清除細胞成分,并完整的保留了ECM的成分及結構。
  二、CDC聯(lián)合心室肌細胞外基質治療大鼠急性心梗的效果研究及通過熒光定量PCR檢測雄性大鼠sry基因片段半定量比較移植CDC的定植和存活
  四組(E組,EC

19、組,I組,IC組)心梗造模前大鼠體重無明顯差異。各組間心梗造模前及造模后IVS,EDV,ESV,IVEF,F(xiàn)S%,LVIDd,LVIDs均無明顯差異。心梗造模后3周E組,EC組,IC組與I組相比,IVS,EDV,ESV,IVEF,F(xiàn)S%,LVIDd,LVIDs有統(tǒng)計學差異,其中E組與IC組間無統(tǒng)計學差異。心梗3周后,Masson染色法提示與IC組比較,EC組心梗后纖維化陽性面積百分比及纖維化積分光密度OD值均明顯降低。AMI后1周及3周

20、,免疫熒光檢測提示與IC組比較,EC組心肌組織切片內α-SA,c-kit,α-SMA,v-WF陽性表達面積百分比及積分OD值顯著增高。心梗后3周,WB檢測提示與IC組比較,EC組c-kit,v-WF,α-SA,α-SMA表達顯著增加(β-actin為內參)。
  心梗24小時及3周后,分別取EC組合IC組大鼠心梗周邊心肌組織,提取組織DNA,通過熒光定量PCR(2-△△CT法)檢測雄性大鼠sry基因片段半定量分析提示與IC組比較,

21、無論心梗后24小時還是3周后,EC組CDC具有顯著增高的定植率及存活率。
  結論:
  1、本實驗細胞培養(yǎng)法可獲得表達c-kit的CDC細胞,體外研究證實ECM可促進CDC向血管內皮,血管平滑肌,心肌細胞分化;促進增殖,減少凋亡。
  2、本實驗中脫細胞法提取心肌ECM可有效脫掉心肌組織中的細胞成分,且較好的保留了心肌ECM的成分和結構。
  3、在體實驗證實CDC聯(lián)合ECM治療大鼠急性心梗能夠改善心臟功能及心

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