改良ISET(CTC-Biopsy)技術(shù)體系的優(yōu)化及其檢測腫瘤患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞效果的驗證.pdf

1、背景：循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating Tumor Cells，CTCs）是從實體瘤浸潤轉(zhuǎn)移或脫落而存在于外周血循環(huán)中的一類腫瘤細(xì)胞，它與腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。臨床研究表明，外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的數(shù)量與腫瘤患者的臨床分期、疾病狀態(tài)等密切相關(guān)。但是由于CTCs數(shù)量極少，對其進(jìn)行研究必須先進(jìn)行富集。膜濾過分離技術(shù)（Isolating by size of epithelial tumor cells，ISET）技術(shù)利用腫瘤細(xì)胞體積通常

2、大于正常血細(xì)胞，并且變形性也比正常血細(xì)胞差的原理，將大體積細(xì)胞篩選截留在濾膜表面，再通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)的方法進(jìn)行定性。
　　目的：本課題組前期對ISET技術(shù)進(jìn)行改良研究，開發(fā)出了自動化檢測設(shè)備CTC-Biopsy。本實驗的目的是完善和優(yōu)化CTC-Biopsy檢測系統(tǒng)，并通過臨床試驗驗證其檢測腫瘤患者外周血中CTC的效果，探討其臨床推廣應(yīng)用的價值。
　　方法：1.使用A549、FADU、MB-MDK-468、PC3、

3、PAN-2、MGC803、SMMC7721等腫瘤細(xì)胞系分別采用Millipore濾膜和CTC-Biopsy濾膜從以下4個方面對CTC-Biopsy檢測系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化：1）應(yīng)用多種腫瘤細(xì)胞系細(xì)胞經(jīng)CTC-Biopsy檢測系統(tǒng)檢測后染色效果的研究；2）應(yīng)用多種腫瘤細(xì)胞系模擬全血環(huán)境下經(jīng)CTC-Biopsy系統(tǒng)檢測細(xì)胞染色效果的研究；3）應(yīng)用多種腫瘤細(xì)胞系模擬外周血環(huán)境下應(yīng)用CTC-Biopsy檢測系統(tǒng)檢測腫瘤細(xì)胞的截留率；4）應(yīng)用多種腫瘤細(xì)胞

4、系模擬外周血環(huán)境下應(yīng)用CTC-Biopsy檢測系統(tǒng)檢測腫瘤細(xì)胞的截留穩(wěn)定性和可重復(fù)性。
　　2.分別使用單個和成團(tuán)(SMMC7721)腫瘤細(xì)胞系研究CTC-Biopsy檢測系統(tǒng)檢測過程中高速離心對CTM檢出結(jié)果的影響。
　　3.通過免疫化學(xué)細(xì)胞學(xué)技術(shù)定性驗證了CTC-Biopsy檢測系統(tǒng)檢測腫瘤患者外周血CTC、CTM的準(zhǔn)確性。
　　4.按照中國國家食品藥品監(jiān)督局（CFDA，China Food and Drug Ad

5、ministration）的藥物臨床試驗管理規(guī)范（GCP，Good Clinical Practice）要求使用CTC-Biopsy檢測系統(tǒng)對156例腫瘤患者及22例健康志愿者進(jìn)行了臨床試驗。
　　結(jié)果：1.1）腫瘤細(xì)胞系細(xì)胞經(jīng)CTC-Biopsy檢測系統(tǒng)染色后，細(xì)胞核與胞漿對比明顯，細(xì)胞核內(nèi)結(jié)構(gòu)清晰，達(dá)到細(xì)胞病理學(xué)診斷要求；分別使用 Millipore濾膜和CTC-Biopsy濾膜對比研究發(fā)現(xiàn)：CTC-Biopsy濾膜較Mill

6、ipore濾膜過濾染色腫瘤細(xì)胞系相比背景更清晰，透光度更好。
　　2）CTC-Biopsy檢測系統(tǒng)分別使用Millipore和CTC-Biopsy濾膜進(jìn)行了模擬實驗結(jié)果顯示腫瘤細(xì)胞加入全血后經(jīng)CTC-Biopsy濾膜過濾染色后背景清晰，濾膜表面僅有少量淋巴細(xì)胞殘留，不影響對結(jié)果判別；腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核、漿對比明顯，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)形態(tài)清晰，達(dá)到細(xì)胞病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)，CTC-Biopsy濾膜相較于Millipore濾膜具有更高的透光性，便于鏡

7、下觀察，濾膜背景更清晰。
　　3）應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)計算得出CTC-Biopsy檢測系統(tǒng)使用CTC-Biopsy濾膜檢測的等量不同類型腫瘤細(xì)胞系細(xì)胞截留率均在85％以上，而應(yīng)用 Millipore濾膜時獲得的截留率均大于70%。
　　4）CTC-Biopsy檢測應(yīng)用 CTC-Biopsy濾膜檢測不同數(shù)量的腫瘤細(xì)胞截留率66.7-90.4%高于使用 Millipore濾膜時58.3%-78.5%，CV值2.9-10.8%低于

8、使用 Millipore濾膜時4.8-12.4%。
　　2.在模擬的人體血液環(huán)境中，單個的腫瘤細(xì)胞經(jīng)過 CTC-Biopsy檢測系統(tǒng)經(jīng)過血樣預(yù)處理處理后，不聚集產(chǎn)生成團(tuán)腫瘤細(xì)胞；結(jié)合CTC-Biopsy檢測系統(tǒng)檢測步驟中高速離心導(dǎo)致CTM打散的模擬實驗的結(jié)論：成團(tuán)腫瘤細(xì)胞在離心等預(yù)處理過程中部分被打散，其原因可能有：①培養(yǎng)的成團(tuán)腫瘤細(xì)胞相對粘附比較松散與實際的CTM有一定差距；②高速離心可能將細(xì)胞團(tuán)打散；③腫瘤細(xì)胞并不固定3個或5

9、個細(xì)胞為一團(tuán)，因此在計數(shù)可能存在一定的誤差。但由此也推斷出結(jié)論，即：如果應(yīng)用CTC-Biopsy檢測系統(tǒng)在腫瘤患者血液樣本中查到成團(tuán)腫瘤細(xì)胞即CTM，可以認(rèn)為這些細(xì)胞之間粘連非常緊密，具有癌栓的特征，或者更具有成為癌栓的潛力。我們推論，在腫瘤患者外周血中檢測到的CTM并不因為CTC-Biopsy檢測系統(tǒng)產(chǎn)生，而是患者本身在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中腫瘤細(xì)胞聚集粘附而產(chǎn)生。
　　3.本實驗檢測結(jié)果表明CTC-Biopsy檢測系統(tǒng)所截獲的細(xì)

10、胞中，根據(jù)形態(tài)學(xué)判斷標(biāo)準(zhǔn)判定的 CTC、CTM，均獲得免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的驗證證實，細(xì)胞形態(tài)學(xué)判斷標(biāo)準(zhǔn)可用于CTC、CTM的判斷；CTC-Biopsy檢測系統(tǒng)染色與免疫熒光染色可檢測發(fā)生EMT的CTC、CTM。
　　4. GCP臨床試驗共檢測樣本為178例，實際有效檢測樣本為172例，其中健康受試者22例，腫瘤受試者150例，男性133例，女性45例，年齡范圍25-81歲，其中肺癌11例，食管癌28例，胃癌44例，結(jié)直腸癌46例，肝

11、癌9例，腎癌12例；CTC-Biopsy檢測系統(tǒng)檢測不分病種惡性腫瘤疾病靈敏度：51.33%，特異性：100%，假陽性率：0.00%，假陰性率：48.67%，陽性預(yù)測值：100%，陰性預(yù)測值：23.16%，約登指數(shù)：0.513。不分病種腫瘤Ⅳ期患者與Ⅰ-Ⅲ期患者檢出率無顯著性差異；除胃癌外各病種各分期之間檢出率無顯著性差異；胃癌Ⅳ期患者檢出率顯著高于Ⅰ-Ⅲ期患者（P=0.002）。本次臨床試驗?zāi)[瘤組病例檢出率為51.33%；高于優(yōu)化檢測

12、程序（梯度離心預(yù)處理血樣）的檢出率27.91%。CTC-Biopsy檢測系統(tǒng)檢測的染色標(biāo)本背景干凈、細(xì)胞形態(tài)清晰、細(xì)胞核質(zhì)分界清楚；除異常細(xì)胞外，樣片中僅殘留少量的單核細(xì)胞。由CTC-Biopsy檢測系統(tǒng)的CTC檢出率的95%CI下限為43.33%，大于國際ISET法報道的43.06%。
　　結(jié)論：1. CTC-Biopsy檢測系統(tǒng)的細(xì)胞染色效果達(dá)到細(xì)胞病理學(xué)診斷要求，截留率達(dá)到國際同類檢測系統(tǒng)水平，并且穩(wěn)定性好、可重復(fù)性強(qiáng)。

13、r>　　2.CTC-Biopsy檢測系統(tǒng)檢測過程中不產(chǎn)生CTM；腫瘤患者外周血中部分CTC及CTM中部分細(xì)胞存在EMT現(xiàn)象。
　　3.通過免疫熒光驗證了CTC-Biopsy檢測系統(tǒng)檢測腫瘤患者外周血中CTC、CTM的性質(zhì)，證實了形態(tài)學(xué)判斷標(biāo)準(zhǔn)的正確性；
　　4.通過GCP臨床試驗證實CTC-Biopsy檢測系統(tǒng)檢測腫瘤患者外周血中CTC靈敏度、特異性等指標(biāo)均達(dá)到國際同類檢測系統(tǒng)水平；該系統(tǒng)檢測操作簡便易行，具有高效、穩(wěn)定、經(jīng)