miR-6X軸調(diào)控乳腺癌Herceptin耐藥的研究.pdf

1、乳腺癌，大多診斷為惡性，雖然隨著生活節(jié)奏和飲食規(guī)律的改變，近年來(lái)在男性中也不斷出現(xiàn)確診病例，但乳腺癌在女性中更為常見(jiàn)。讓人頭疼的是乳腺癌在不斷“進(jìn)化”后擁有著越來(lái)越高的發(fā)病率，更加不幸的是在年輕女性中不斷有確診病例的出現(xiàn)。赫賽汀(Herceptin)是一種人源化的可用于臨床的注射用單克隆抗體，是一線治療乳腺癌的藥物，主要用于HER2(Human Epidermal GrowthFactor Receptor2)過(guò)度表達(dá)的患者。Herce

2、ptin能夠干擾HER2下游信號(hào)通路并最終抑制乳腺腫瘤的增長(zhǎng)。但Herceptin的有效性受HER2表達(dá)情況的限制，而且病人耐藥現(xiàn)象多有出現(xiàn)，多數(shù)發(fā)生在原本治療有效的一年到兩年內(nèi)。目前針對(duì)Herceptin作用機(jī)制的研究已經(jīng)相對(duì)成熟，而對(duì)其耐藥機(jī)制的研究較少，因此深入研究其耐藥機(jī)制就顯得尤為重要，以便準(zhǔn)確定位Herceptin治療的群體，大大提升Herceptin治療的有效性，最終達(dá)到減小Herceptin耐藥在臨床治療中的阻力。

3、>　　目的:探究miR-6X(microRNA-6X)調(diào)控Herceptin治療敏感性的作用及其機(jī)制，為更好地實(shí)施乳腺癌抗HER2治療，減少及避免耐藥提供重要的理論依據(jù)和潛在的分子靶標(biāo)。
　　方法:首先，利用Herceptin耐藥細(xì)胞株做mi croRNA芯片檢測(cè)，篩選耐藥相關(guān)的microRNA，找到表達(dá)下調(diào)明顯且目前沒(méi)有報(bào)道的miR-6X。接著，利用基因截短突變體和細(xì)胞熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)找到受Herceptin調(diào)控的miR-6X啟

4、動(dòng)子區(qū)域，再根據(jù)文獻(xiàn)支持和數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)尋找并確定結(jié)合在該啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子CEBP(CCAAT Enhancer Binding Proteins);qRT-PCR(Quantitative Real-Time-PolymeraseChain Reaction)方法檢測(cè)CEBP對(duì)miR-6X表達(dá)的影響;利用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)CEBP是否募集到miR-6X啟動(dòng)子上并且這種募集是否受Herceptin影響;采用RNA干擾技術(shù)，敲低CEB

5、P，qRT-PCR方法探究miR-6X變化情況;利用Western Blot檢測(cè)miR-6X在蛋白水平對(duì)IGF1R(Insulin-like Growth Factor1Receptor)表達(dá)的影響;利用報(bào)告基因活性實(shí)驗(yàn)技術(shù)，研究miR-6X是否直接靶向IGF1R;利用細(xì)胞耐藥曲線和軟瓊脂形成實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)CEBP/miR-6X是否通過(guò)靶向IGF1R增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)Herceptin敏感性;Western Blot檢測(cè)CEBP/miR-6X

6、是否通過(guò)靶向IGF1R抑制pAKT/pERK(phosphorylation Protein Kinase B/phosphorylationExtracellular Signal-Regulated Kinase)通路;細(xì)胞耐藥曲線、軟瓊脂形成實(shí)驗(yàn)和Western Blot檢測(cè)CEBP增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)Herceptin敏感性是否通過(guò)miR-6X，另外也利用上述技術(shù)檢測(cè)CEBP、miR-6X兩者是否都通過(guò)pERK/pAKT通路增加He

7、rceptin敏感性;活體成像和HE(Hematoxylin and Eosin)染色檢測(cè)miR-6X在體內(nèi)對(duì)乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的影響;RNA原位雜交、免疫組織化學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析檢測(cè)CEBP、miR-6X和IGF1R在乳腺癌中表達(dá)情況以及兩兩之間的相關(guān)關(guān)系;免疫組織化學(xué)和生存期統(tǒng)計(jì)學(xué)分析分別檢測(cè)接受和不接受Herceptin治療患者中，CEBP/miR-6X高表達(dá)對(duì)無(wú)復(fù)發(fā)生存和總生存時(shí)間的影響。
　　結(jié)果:1.利用Herceptin耐藥細(xì)

8、胞系MDA-MB-453/MDA-MB-453R提取總RNA，進(jìn)行microRNA芯片檢測(cè)，尋找與Herceptin耐藥有關(guān)的microRNA，顯示miR-6X下調(diào)最明顯且目前沒(méi)有報(bào)道。
　　2.構(gòu)建miR-6X截短突變體，轉(zhuǎn)染ZR75-1細(xì)胞并分別設(shè)定加和不加Herceptin兩個(gè)對(duì)照，檢測(cè)細(xì)胞活性。找到miR-6X啟動(dòng)子區(qū)域中受Herceptin影響的區(qū)域，再根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)找到結(jié)合在該區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子CEBP。
　　3.分

9、別在ZR75-1/MCF-7/MDA-MB-453細(xì)胞中轉(zhuǎn)染不同劑量的Myc-CEBP，提取總RNA并做microRNA反轉(zhuǎn)錄，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CEBP上調(diào)miR-6X表達(dá)且有劑量效應(yīng)。
　　4.對(duì)ZR75-1細(xì)胞分別做加和不加Herceptin處理，利用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn):CEBP能募集到miR-6X啟動(dòng)子上并且這種募集受到Herceptin抑制。
　　5.ZR75-1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染CEBP shRNA1

10、、CEBP shRNA2，敲低CEBP，并做Herceptin處理對(duì)照，提取總RNA并做microRNA反轉(zhuǎn)錄，qRT-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Herceptin能下調(diào)miR-6X表達(dá)，而敲低CEBP后Herceptin不再能下調(diào)miR-6X表達(dá)。
　　6.首先根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)尋找乳腺癌相關(guān)的癌基因，ZR75-1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-6X，利用Western Blot找到miR-6X能夠下調(diào)的基因，選定下調(diào)最明顯且尚無(wú)報(bào)道的IGF1R;接著，在

11、ZR75-1/MCF-7/MDA-MB-453分別轉(zhuǎn)染miR-6X，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-6X的IGF1R的蛋白水平明顯低于對(duì)照組;而轉(zhuǎn)染miR-6X inhibitor則IGF1R蛋白水平明顯高于對(duì)照組。
　　7.構(gòu)建IGF1R3'UTR(Universal Training Reactor)表達(dá)載體及其突變體，將miR-6X轉(zhuǎn)入ZR75-1/MCF-7/MDA-MB-453細(xì)胞，測(cè)定報(bào)告基因活性，結(jié)果顯示miR-6X降低IGF1R3

12、'UTR活性，而IGF1R3'UTR突變后抑制作用消失。
　　8.ZR75-1/MCF-7中轉(zhuǎn)染IGF1R shRNA和miR-6X后做細(xì)胞耐藥曲線和軟瓊脂形成實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn):CEBP和miR-6X均能夠增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)Herceptin敏感性，但是敲低IGF1R之后，CEBP和miR-6X均不能夠增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)Herceptin敏感性。
　　9.ZR75-1/MCF-7中轉(zhuǎn)染IGF1R shRNA和miR-6X后做Weste

13、rn Blot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CEBP和miR-6X均能夠抑制pAKT/pERK通路，但是敲低IGF1R之后，CEBP和miR-6X均不能夠抑制pAKT/pERK通路。
　　10.ZR75-1中轉(zhuǎn)染Myc-CEBP和miR-6X inhibitor后，做細(xì)胞耐藥曲線、軟瓊脂形成實(shí)驗(yàn)和Western Blot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn):CEBP增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)Herceptin敏感性，而敲低miR-6X后，CEBP不能增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)Herceptin敏

14、感性;CEBP能夠抑制IGF1R蛋白水平和pAKT/pERK通路，而敲低miR-6X后抑制作用消失。
　　11.ZR75-1中轉(zhuǎn)染Myc-CEBP并加入LY（AKT抑制劑）/PD（ERK抑制劑）后，進(jìn)行細(xì)胞耐藥曲線和軟瓊脂形成實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn):CEBP增加Herceptin敏感性，而抑制pAKT/pERK通路后，CEBP不能增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)Herceptin敏感性。
　　12.ZR75-1中轉(zhuǎn)染miR-6X并加入LY/PD后，進(jìn)行

15、細(xì)胞耐藥曲線和軟瓊脂形成實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn):miR-6X增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)Herceptin敏感性，而抑制pAKT/pERK通路后，miR-6X不能增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)Herceptin敏感性。
　　13.給成瘤的裸鼠注射miR-6X Ago-miR和Herceptin，進(jìn)行活體成像檢測(cè)發(fā)現(xiàn):miR-6X Ago-miR可以抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移，并且miR-6X Ago-miR可以增加Herceptin敏感性;解剖裸鼠;HE染色肺部，發(fā)現(xiàn):miR-

16、6X在體內(nèi)抑制乳腺癌肺轉(zhuǎn)移，并可以增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)Herceptin敏感性。
　　14.乳腺癌標(biāo)本做RNA原位雜交并統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)CEBP和miR-6X:癌中表達(dá)明顯高于癌旁;而IGF1R在乳腺癌中:癌中表達(dá)明顯低于癌旁。
　　15.乳腺癌標(biāo)本做免疫組織化學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)CEBP和miR-6X的表達(dá)成正相關(guān)關(guān)系，CEBP/miR-6X和IGF1R的表達(dá)均成負(fù)相關(guān)。
　　16.對(duì)103例接受Herceptin治療的乳

17、腺癌患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存和總生存時(shí)間做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)CEBP/miR-6X高表達(dá)時(shí)，無(wú)復(fù)發(fā)生存和總生存的時(shí)間更長(zhǎng)，P值有意義;對(duì)109例未接受Herceptin治療的乳腺癌患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存和總生存時(shí)間做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果和接受Herceptin治療的群體一樣，但P值無(wú)意義。
　　結(jié)論:1.miR-6X是與Herceptin耐藥有關(guān)的microRNA之一
　　2.Herceptin通過(guò)抑制miR-6X的轉(zhuǎn)錄因子CEBP抑制miR-