擠壓式生物3D打印機(jī)初建與仿生細(xì)胞分布組織工程軟骨體外初步驗(yàn)證.pdf

1、研究背景:細(xì)胞是生命結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，生物打印技術(shù)將細(xì)胞作為生物墨水打印構(gòu)建組織和器官，標(biāo)志著3D打印技術(shù)與生命科學(xué)的真正融合。與通常3D打印技術(shù)強(qiáng)調(diào)產(chǎn)品的制造精度和機(jī)械強(qiáng)度不同，生物打印技術(shù)更多的考慮的是細(xì)胞生物學(xué)表現(xiàn)。生物打印平臺(tái)的構(gòu)建、打印方案的設(shè)計(jì)和打印后產(chǎn)品的評(píng)價(jià)都圍繞著細(xì)胞展開(kāi)。由于生命科學(xué)極端復(fù)雜、多變，人類對(duì)細(xì)胞的理解十分粗淺，有太多的未知等待著探索，即使在科技發(fā)展日新月異的今天，生物打印技術(shù)仍然處在萌芽階段，現(xiàn)階段

2、生物打印技術(shù)的研發(fā)與應(yīng)用仍然屬于概念驗(yàn)證，距離實(shí)現(xiàn)具備生理功能的組織、器官的人工打印再造的目標(biāo)仍有很長(zhǎng)的路要走。
　　生物打印平臺(tái)的建立是實(shí)現(xiàn)生物制造的必要條件，亦是生物打印領(lǐng)域內(nèi)面臨諸多挑戰(zhàn)之一。生物打印機(jī)絕不是簡(jiǎn)簡(jiǎn)單單堆砌細(xì)胞和生物材料的裝置，打印平臺(tái)的建立代表了細(xì)胞生物學(xué)、生物材料學(xué)、自動(dòng)控制、信息學(xué)等諸多學(xué)科高水平交叉綜合應(yīng)用的實(shí)力，體現(xiàn)了對(duì)生物打印核心技術(shù)的掌握。目前生物打印平臺(tái)的搭建技術(shù)并不成熟，根據(jù)打印的細(xì)胞、生物材

3、料以及打印的目的不同，生物打印平臺(tái)構(gòu)建形式也多種多樣。世界上僅有少數(shù)幾個(gè)發(fā)達(dá)國(guó)家有能力開(kāi)發(fā)商品化細(xì)胞生物打印機(jī)，雖然這種生物打印機(jī)具有產(chǎn)品集成化程度高，操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，但由于打印材料有限，打印平臺(tái)軟硬件受專利保護(hù)，無(wú)法根據(jù)打印實(shí)際需要進(jìn)行參數(shù)修改和軟硬件升級(jí)、優(yōu)化，商品化細(xì)胞生物打印機(jī)并未得到廣泛應(yīng)用。
　　關(guān)節(jié)軟骨由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成，沒(méi)有血管、神經(jīng)和淋巴，幾乎沒(méi)有自我修復(fù)能力。一旦發(fā)生軟骨損傷往往導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能不可逆損害，

4、最終引起骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。軟骨損傷修復(fù)尚無(wú)理想的治療手段，軟骨組織工程聯(lián)合應(yīng)用生命科學(xué)和工程制造的方法人工合成軟骨組織，是當(dāng)前最有希望解決軟骨缺損修復(fù)困境的方法。分層構(gòu)建組織工程軟骨是軟骨組織工程領(lǐng)域內(nèi)的研究熱點(diǎn)，強(qiáng)調(diào)從結(jié)構(gòu)和功能上模擬天然軟骨分層變化的規(guī)律。在哺乳動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨組織中，都存在著軟骨細(xì)胞密度由軟骨淺層至深層成梯度下降的分布規(guī)律，這是關(guān)節(jié)軟骨發(fā)育和力學(xué)環(huán)境共同作用的結(jié)果，是關(guān)節(jié)軟骨重要的分層結(jié)構(gòu)特點(diǎn)之一。復(fù)習(xí)文

5、獻(xiàn)，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)研究關(guān)注構(gòu)建具備仿生軟骨細(xì)胞密度梯度分布規(guī)律的組織工程軟骨。
　　本研究期望自主建立擠壓式水凝膠細(xì)胞生物打印機(jī)驗(yàn)證平臺(tái)，初步掌握3D生物打印核心技術(shù)，嘗試通過(guò)生物打印技術(shù)構(gòu)建具備仿生軟骨細(xì)胞密度梯度分布的組織工程軟骨，驗(yàn)證生物打印技術(shù)在軟骨組織工程中的應(yīng)用，觀察軟骨細(xì)胞密度梯度分布生物學(xué)作用，探索一種分層構(gòu)建組織工程軟骨的新策略。
　　方法:本研究利用開(kāi)源軟硬件資料嘗試自主搭建擠壓式水凝膠生物打印驗(yàn)證平臺(tái)，硬件

6、系統(tǒng)包括：Prusa i3三維打印機(jī)移動(dòng)系統(tǒng)，數(shù)控微量凝膠擠壓系統(tǒng)；軟件應(yīng)用包括：三維電腦輔助設(shè)計(jì)軟件（CAD軟件）Solidworks、切片軟件 Slic3r、打印機(jī)上位控制軟件Repetier-Host；選用3ml螺旋接口注射器作為水凝膠容器（生物打印墨水墨盒），25＃平頭針頭作為擠壓成型噴頭，10％豬膝關(guān)節(jié)軟骨II型膠原蛋白鹽酸（0.15M）水溶膠作為打印墨水；安裝Prusa i3三維打印機(jī)移動(dòng)系統(tǒng)和數(shù)控微量凝膠擠壓系統(tǒng)構(gòu)成擠壓式

7、水凝膠生物打印驗(yàn)證平臺(tái)，使用Solidworks軟件設(shè)計(jì)三維實(shí)體模型，在切片軟件Slic3r中設(shè)置打印層厚、打印條帶走形方向及打印速度等參數(shù)，分割三維實(shí)體模型生成連續(xù)的二維輪廓，生物打印機(jī)在生成的Gcode代碼文件控制下完成水凝膠打印，打印成型的II型膠原溶膠塊置于37℃孵箱內(nèi)30分鐘完成交聯(lián)；
　　本研究通過(guò)生物打印技術(shù)構(gòu)建具備仿生軟骨細(xì)胞密度梯度分布的組織工程軟骨，實(shí)驗(yàn)參考正常成人膝關(guān)節(jié)股骨髁軟骨中軟骨細(xì)胞總體密度約為1×10

8、7cell/mL，關(guān)節(jié)軟骨淺、中、深三層細(xì)胞密度之比約3：2：1，使用復(fù)合不同軟骨細(xì)胞密度的10%II型膠原蛋白水溶膠作為生物墨水，設(shè)計(jì)A組（細(xì)胞總體密度約為2×107cell/ml）、 B組（細(xì)胞總體密度約為1×107cell/mL）、 C組（細(xì)胞總體密度約為0.5×107cell/mL）三組組織工程軟骨，每組分別構(gòu)建具有仿生軟骨細(xì)胞密度梯度分布和細(xì)胞均勻分布的兩類細(xì)胞分布形式組織工程軟骨，體外培養(yǎng)，分別于第0、1、2、3周取材，進(jìn)行

9、細(xì)胞學(xué)、生化、組織學(xué)等相關(guān)檢測(cè)，對(duì)比分析仿生軟骨細(xì)胞密度梯度分布和細(xì)胞均勻分布的兩類組織工程軟骨，驗(yàn)證生物打印技術(shù)，觀察仿生細(xì)胞密度梯度分布的生物學(xué)意義。
　　結(jié)果：擠壓式水凝膠生物3D打印驗(yàn)證平臺(tái)得到初步建立，擠壓頭與三維運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)匹配，系統(tǒng)運(yùn)行平穩(wěn)，打印過(guò)程全程可控，通過(guò)優(yōu)化打印參數(shù)，3D細(xì)胞生物打印過(guò)程對(duì)細(xì)胞活性無(wú)明顯影響；擠壓式水凝膠生物3D打印平臺(tái)能夠?qū)崿F(xiàn)仿生軟骨細(xì)胞密度梯度分布組織工程軟骨模型的構(gòu)建，組織工程軟骨體外培養(yǎng)

10、3周，RT-qPCR結(jié)果顯示：組織工程軟骨中軟骨細(xì)胞基因COL1A1持續(xù)低水平表達(dá)且出現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，基因COL2A1和ACAN表達(dá)水平隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)呈上調(diào)趨勢(shì)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；核酸定量法測(cè)定組織工程軟骨細(xì)胞總量結(jié)果顯示：各時(shí)間點(diǎn)A、B、C三組中兩類組織工程軟骨（細(xì)胞均勻分布組織塊與細(xì)胞梯度分布組織塊）細(xì)胞總量無(wú)統(tǒng)計(jì)差異，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)各組組織工程軟骨細(xì)胞總量均出現(xiàn)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的下降趨勢(shì)；組織工程軟骨樣本GAG定量結(jié)果顯示：體外培養(yǎng)第1周

11、，A、B、C三組GAG總量與支架中細(xì)胞總體密度呈正相關(guān)，A組GAG含量最高，C組最低；培養(yǎng)第2、3周，C組GAG總量仍然最低，A組和B組GAG含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，為評(píng)估單個(gè)細(xì)胞GAG合成活性，分別將各組GAG總量與細(xì)胞總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化處理，體外培養(yǎng)第1周，各組間單細(xì)胞GAG合成量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，在第2、3周，A組單細(xì)胞GAG合成量最低， B組具有最高的單細(xì)胞GAG合成量，B組中兩類細(xì)胞分布組織塊單細(xì)胞GAG合成量無(wú)統(tǒng)計(jì)差異，但B組細(xì)胞密度梯度分布

12、組織塊單細(xì)胞GAG合成量與A、C兩組有統(tǒng)計(jì)差異，培養(yǎng)第3周，B、C兩組中細(xì)胞均勻分布組織塊單細(xì)胞GAG合成量有統(tǒng)計(jì)差異；免疫組化染色及阿爾新蘭染色結(jié)果顯示：免疫組化陽(yáng)性染色細(xì)胞呈棕黃色，免疫組化陰性染色細(xì)胞呈藍(lán)色，GAG成分被阿爾新蘭染成藍(lán)色，組織工程軟骨中絕大多數(shù)軟骨細(xì)胞表現(xiàn)為 II型膠原蛋白陽(yáng)性染色，一部分軟骨細(xì)胞表現(xiàn)為PRG4陽(yáng)性，只有少數(shù)軟骨細(xì)胞出現(xiàn)I型膠原陽(yáng)性染色，細(xì)胞密度梯度組軟骨細(xì)胞新和成的II型膠原蛋白、PRG4和GAG

13、成分呈現(xiàn)梯度分布規(guī)律，由淺層至深層逐漸減少。
　　結(jié)論：在熟悉并掌握生物3D打印相關(guān)基本原理和各系統(tǒng)軟硬件組成基礎(chǔ)之上，綜合應(yīng)用機(jī)械自動(dòng)控制技術(shù)和生命科學(xué)理論，能夠根據(jù)具體生物墨水和實(shí)際打印需要，利用開(kāi)源軟硬件資料自主設(shè)計(jì)并建立擠壓式水凝膠生物打印驗(yàn)證平臺(tái)，通過(guò)仿生細(xì)胞分布組織工程軟骨模型的建立，驗(yàn)證了擠壓式水凝膠生物打印驗(yàn)證平臺(tái)能夠?qū)崿F(xiàn)軟骨細(xì)胞在水凝膠支架中精確的空間定位，通過(guò)優(yōu)化支架中細(xì)胞種植密度和分布模式能夠提高細(xì)胞活性，研