PTPN21基因在急性淋巴細(xì)胞白血病的增殖周期和耐藥中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　急性淋巴細(xì)胞白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia，ALL)，是一種以骨髓、外周血和其他器官中未成熟淋巴細(xì)胞的異常增殖為特點(diǎn)的惡性克隆性疾病，成人ALL具有長(zhǎng)期預(yù)后差、復(fù)發(fā)后生存率低的特點(diǎn)。在ALL的發(fā)病機(jī)制中，遺傳學(xué)改變發(fā)揮了關(guān)鍵作用，探索ALL的遺傳學(xué)特點(diǎn)不僅有助于明確發(fā)病機(jī)制，更有助于指導(dǎo)臨床治療。
　　既往研究報(bào)道PTKs和PTPs的基因突變或表達(dá)量異常導(dǎo)致信號(hào)通路分子異常的

2、磷酸化或去磷酸化過(guò)程，導(dǎo)致細(xì)胞的增殖增加、分化異常或凋亡改變從而在ALL的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。PTPN21基因編碼蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型21，以往報(bào)道其在腫瘤組織中高表達(dá)并參與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，但PTPN21基因是否在ALL中異常高表達(dá)尚不明確，PTPN21基因在ALL中發(fā)揮何種作用尚有待研究。
　　本研究通過(guò)檢測(cè)ALL患者骨髓標(biāo)本發(fā)現(xiàn)PTPN21基因的異常高表達(dá)，進(jìn)一步通過(guò)慢病毒感染在ALL的細(xì)胞株中過(guò)表達(dá)PTPN21基因或

3、利用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除PTPN21基因，檢測(cè)PTPN21表達(dá)量的改變對(duì)細(xì)胞的凋亡、增殖周期以及耐藥的影響，并探索相關(guān)機(jī)制。
　　第一章 PTPN21基因的過(guò)表達(dá)在急性淋巴細(xì)胞白血病的增殖周期和耐藥中的作用及機(jī)制研究
　　目的:
　　研究PTPN21基因在急性淋巴細(xì)胞白血病中的作用，探索PTPN21是否參與細(xì)胞的增殖周期的調(diào)控和耐藥的發(fā)生，闡明相關(guān)機(jī)制。
　　方法:
　　通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)AL

4、L患者和對(duì)照組骨髓標(biāo)本中的PTPN21基因的mRNA水平;慢病毒感染的方法在ALL細(xì)胞株:Jurkat、NALM-6和Reh細(xì)胞中過(guò)表達(dá)PTPN21基因;Western blotting和免疫熒光鑒定PTPN21蛋白的過(guò)表達(dá)和檢測(cè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的效率;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ALL細(xì)胞過(guò)表達(dá)組和對(duì)照組的凋亡和增殖周期;Western blotting檢測(cè)Src和MAPK通路的磷酸化水平;MAPK通路小分子抑制劑實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相關(guān)通路的作用;柔紅霉素處理過(guò)表達(dá)

5、組和對(duì)照組細(xì)胞并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡來(lái)研究ALL細(xì)胞的耐藥;數(shù)字基因表達(dá)譜測(cè)序篩選差異表達(dá)基因，熒光定量PCR驗(yàn)證，探索耐藥相關(guān)機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　ALL患者中PTPN21基因的mRNA水平異常增高，并且初診和復(fù)發(fā)的患者中PTPN21基因顯著高表達(dá)，而完全緩解的患者PTPN21基因的mRNA水平與對(duì)照組無(wú)顯著性差異;在Jurkat、NALM-6和Reh細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)PTPN21基因不影響細(xì)胞的凋亡，過(guò)表達(dá)組的G0期細(xì)胞

6、比例均顯著性低于對(duì)照組，而S/G2/M期細(xì)胞比例則顯著性高于對(duì)照組，兩組的G1期細(xì)胞比例無(wú)顯著性差異，表明PTPN21基因的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了Jurkat、NALM-6和Reh細(xì)胞的增殖;Jurkat細(xì)胞中過(guò)表達(dá)組的Src的磷酸化水平明顯減弱，ERK1/2和JNK的磷酸化水平明顯增強(qiáng)，p38的磷酸化水平無(wú)明顯變化;NALM-6細(xì)胞過(guò)表達(dá)組的Src的磷酸化水平明顯減弱，ERK1/2和p38的磷酸化水平明顯增強(qiáng)，JNK的磷酸化水平無(wú)顯著性變化;R

7、eh細(xì)胞過(guò)表達(dá)組的Src的磷酸化水平明顯減弱，ERK1/2、p38和JNK的磷酸化水平均明顯增強(qiáng);ERK1/2通路抑制劑PD98059并不影響PTPN21的促進(jìn)ALL細(xì)胞增殖的作用;JNK通路抑制劑SP600125能有效逆轉(zhuǎn)PTPN21的促進(jìn)Jurkat細(xì)胞增殖的作用，但不能逆轉(zhuǎn)PTPN21的促進(jìn)Reh細(xì)胞增殖的作用;p38通路抑制劑SB203580能有效逆轉(zhuǎn)PTPN21的促進(jìn)NALM-6細(xì)胞增殖的作用，并且能部分逆轉(zhuǎn)PTPN21的促進(jìn)

8、Reh細(xì)胞增殖的作用;PTPN21基因抑制了Jurkat和NALM-6細(xì)胞對(duì)柔紅霉素的敏感性;數(shù)字基因表達(dá)譜測(cè)序初步篩選，熒光定量PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)IL22RA1基因的mRNA水平上調(diào)。
　　結(jié)論:
　　PTPN21基因的異常高表達(dá)可能參與了ALL的發(fā)病和復(fù)發(fā);PTPN21可能通過(guò)去磷酸化Src激活其激酶活性，進(jìn)一步激活下游MAPK通路，從而促進(jìn)了ALL細(xì)胞的增殖;參與PTPN21調(diào)控細(xì)胞增殖的MAPK通路可能在不同來(lái)源細(xì)胞中通

9、路不同:JNK通路和p38通路可能分別是Jurkat細(xì)胞和NALM-6細(xì)胞中發(fā)揮作用的關(guān)鍵通路;p38通路可能還部分參與了PTPN21基因促Reh細(xì)胞增殖的作用;PTPN21基因可能參與ALL細(xì)胞對(duì)柔紅霉素的耐藥，經(jīng)篩選驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)IL22RA1基因的表達(dá)上調(diào)可能參與PTPN21介導(dǎo)的耐藥。
　　第二章應(yīng)用CRISPR-Cas9技術(shù)在急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株Jurkat中敲除PTPN21基因?qū)υ鲋持芷诘恼{(diào)控作用
　　目的:

10、>　　通過(guò)CRISPR-Cas9技術(shù)建立敲除Jurkat細(xì)胞的PTPN21基因的細(xì)胞系，研究敲除PTPN21基因是否抑制ALL細(xì)胞的增殖。
　　方法:
　　選擇Zhanglab MIT的CRISPR Design tool針對(duì)2號(hào)外顯子和13號(hào)外顯子分別進(jìn)行g(shù)RNA的設(shè)計(jì);以pX458質(zhì)粒作為gRNA的表達(dá)載體;以293T細(xì)胞作為目的細(xì)胞，利用T7E1實(shí)驗(yàn)進(jìn)行不同gRNA的剪切效率檢測(cè);以核轉(zhuǎn)方式在Jurkat細(xì)胞中表達(dá)Ca

11、s9質(zhì)粒;流式細(xì)胞分選儀分選GFP表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞;極限稀釋法進(jìn)行細(xì)胞單克隆的篩選，提取克隆的基因組DNA，PCR擴(kuò)增后測(cè)序;針對(duì)出現(xiàn)雙信號(hào)峰的克隆，利用TA克隆進(jìn)一步測(cè)序明確;利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)篩選獲得的克隆的凋亡和增殖周期。
　　結(jié)果:
　　通過(guò)T7E1實(shí)驗(yàn)選擇分別針對(duì)2號(hào)外顯子和13號(hào)外顯子剪切效率最高的兩條gRNA進(jìn)行Cas9質(zhì)粒的構(gòu)建;通過(guò)測(cè)序篩選共獲得5個(gè)單等位基因突變和6個(gè)雙等位基因突變的克隆，建立了Jurkat