一種半胱氨酸改造的MLIF類似物對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用的研究蘭州地區(qū)健康成人脈沖振蕩肺功能正常值的分析研究.pdf

1、本文對(duì)一種半胱氨酸改造的MLIF類似物對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及蘭州地區(qū)健康成人脈沖振蕩肺功能正常值的分析進(jìn)行了研究。本研究分為兩個(gè)部分：
　　第一部分：缺血性腦血管?。╥schemic cerebrovascular disease。ICVD）是目前在臨床上常見的一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。ICVD發(fā)生時(shí)，缺血再灌注引起的繼發(fā)性損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是急性炎癥反應(yīng)。此時(shí)細(xì)胞因子被大量的釋放、粘附分子的表達(dá)明顯升高，白細(xì)胞及其它免疫細(xì)胞被激

2、活，從而釋放各種炎性介質(zhì)如細(xì)胞因子包括TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、趨化因子及粘附分子等，TNF-α被認(rèn)為是炎癥網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵因子，是全身炎癥反應(yīng)的始動(dòng)介質(zhì)，同時(shí)，缺血再灌注時(shí)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)明顯加速，自由基的平衡被打破，其產(chǎn)生過量而清除減少，這些因素都嚴(yán)重?fù)p傷了神經(jīng)細(xì)胞。因此，減輕炎癥反應(yīng)、減少自由基就對(duì)保護(hù)缺血再灌注后的神經(jīng)功能具有重要意義。單核細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（monocyte locomotion inhibitory

3、 factor，MLIF）是一種抗炎性反應(yīng)的多肽，它能抑制人單核細(xì)胞、多形核白細(xì)胞的移動(dòng)，抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生、逃避宿主免疫，同時(shí)它還對(duì)細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β等的分泌以及相應(yīng)受體的表達(dá)有明顯的抑制作用，從而影響炎癥反應(yīng)的整個(gè)過程。研究表明MLIF的抗炎活性基團(tuán)是Cys-Asn-Ser。本實(shí)驗(yàn)試圖通過對(duì)MLIF的活性基團(tuán)Cys-Asn-Ser的N端進(jìn)行修飾，了解新的修飾后的MLIF類似物對(duì)大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)功能改變及TNF-α、

4、IL-1β表達(dá)的影響，來(lái)研究這種新的MLIF類似物可能的藥理作用機(jī)制，從而為臨床水平的研究提供理論依據(jù)，以便將來(lái)更好地造福缺血性腦病的患者。
　　目的：對(duì)抗炎肽MLIF的活性肽段Cys-Asn-Ser的N端進(jìn)行了全新設(shè)計(jì)和化學(xué)結(jié)構(gòu)改造。為了提高Cys-Asn-Ser的抗氧化活性，我們?cè)贑ys-Asn-Ser的N端連接一個(gè)極性不帶電荷的半胱氨酸。采用固相合成法合成一條全新設(shè)計(jì)的MLIF類似物Cys-Cys-Asn-Ser以及MLIF

5、活性基團(tuán)小分子肽段 Cys-Asn-Ser；建立大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，以 MLIF活性基團(tuán)小分子肽段Cys-Asn-Ser作為對(duì)照，考察這個(gè)新的MLIF類似物對(duì)大鼠缺血性腦病是否具有治療作用，并初步探討這種作用可能的發(fā)生機(jī)制。
　　方法：⑴采用固相合成法，合成一個(gè)新的半胱氨酸改造的MLIF類似物Cys-Cys-Asn-Ser和MLIF的活性基團(tuán)小分子肽段Cys-Asn-Ser，然后對(duì)合成的粗肽進(jìn)行脫鹽處理選用的是Seph

6、adex G10凝膠柱，并結(jié)合制備型HPLC純化粗肽，最后采用MS對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。⑵用線栓來(lái)阻塞大腦中動(dòng)脈，從而構(gòu)建SD大鼠腦缺血再灌注損傷的模型，待造模成功、缺血再灌注24h的時(shí)候，采用Longa法對(duì)大鼠神經(jīng)功能缺損進(jìn)行評(píng)分；大鼠腦切片進(jìn)行 TTC染色，觀察腦缺血再灌注后腦梗死體積的變化，探討這個(gè)新的半胱氨酸改造的MLIF類似物Cys-Cys-Asn-Ser對(duì)缺血性腦病的治療作用。⑶在大鼠腦缺血再灌注24h后，取大鼠腦組織勻漿測(cè)定

7、TNF-α和IL-1β的含量，觀察這個(gè)新改造的MLIF類似物Cys-Cys-Asn-Ser的抗炎活性。
　　結(jié)果：①采用固相合成法獲取的新的由半胱氨酸改造的MLIF類似物Cys-Cys-Asn-Ser和MLIF的活性基團(tuán)小分子肽段Cys-Asn-Ser，前者的產(chǎn)率是40.5％，后者的產(chǎn)率是61.2%，HPLC分離純化后，證明二者的純度均達(dá)到95%以上，且經(jīng)質(zhì)譜對(duì)產(chǎn)物的鑒定，結(jié)構(gòu)完全相符。②實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，模型組大鼠均出現(xiàn)了嚴(yán)重的神

8、經(jīng)功能受損的癥狀，神經(jīng)功能評(píng)分的結(jié)果為(2.20±0.45)；大鼠缺血側(cè)的腦組織有非常明顯的梗死灶，測(cè)得梗死體積為(152.85±28.83)mm3；而與模型組大鼠不同的是，各藥物治療組均在不同程度上改善了MCAO大鼠的病理改變，包括減小腦梗死的體積和降低神經(jīng)功能評(píng)分。與活性基團(tuán)小分子肽段Cys-Asn-Ser相比，新的MLIF類似物Cys-Cys-Asn-Ser的活性有所提高。③從TNF-α和IL-1β的檢測(cè)數(shù)據(jù)來(lái)看，用一個(gè)半胱氨酸對(duì)

9、MLIF活性基團(tuán)小分子肽段Cys-Asn-Ser修飾后，新的MLIF類似物Cys-Cys-Asn-Ser的抗炎活性有所增強(qiáng)。由此可見，新的MLIF類似物Cys-Cys-Asn-Ser有抑制炎癥反應(yīng)的作用，同時(shí)它自身又有著抗氧化的作用，這兩方面的原因使得它對(duì)于缺血性腦損傷有保護(hù)作用。
　　結(jié)論：一種新的MLIF類似物Cys-Cys-Asn-Ser對(duì)缺血性再灌注腦損傷有一定的神經(jīng)保護(hù)作用，同時(shí)其修飾后的抗炎活性比MLIF活性基團(tuán)小分子

10、肽段Cys-Asn-Ser有所增強(qiáng)。
　　第二部分：呼吸系統(tǒng)疾病是嚴(yán)重危害人民健康的常見病、多發(fā)病，已經(jīng)構(gòu)成影響公共健康的重大問題。其不僅發(fā)病率高，許多疾病起病隱襲，肺功能損害嚴(yán)重，致殘率高，給社會(huì)和國(guó)民經(jīng)濟(jì)造成了巨大損失。因此，呼吸系統(tǒng)疾病的早診斷、早治療、早預(yù)防就顯得尤為重要。在呼吸系統(tǒng)疾病的檢查方法中，呼吸功能的測(cè)定已經(jīng)越來(lái)越受到人們的重視，但肺功能檢查常規(guī)項(xiàng)目的信號(hào)源均是受試者自己的呼吸，檢查結(jié)果可靠與否與受試者自己的理解

11、能力和配合能力密切相關(guān)，對(duì)于一些特殊人群如年老、體弱、幼兒等患者，就不能進(jìn)行這樣的檢查，而脈沖振蕩法（impulse oscillometry，IOS）測(cè)定技術(shù)的突出優(yōu)點(diǎn)是受試者僅需平靜呼吸，操作簡(jiǎn)便、適用對(duì)象廣泛，目前在臨床上越來(lái)越受到青睞。影響肺功能檢查的正常值的因素非常多，主要與受試者的種族、年齡、性別、體重、身高等因素密切相關(guān)，其次還與受試者的生存環(huán)境、工種、體力活動(dòng)及吸煙與否等因素也有關(guān)。因此，臨床上選取合適的預(yù)計(jì)值，才是提高

12、診斷準(zhǔn)確率的關(guān)鍵。中國(guó)目前仍然沒有統(tǒng)一的脈沖振蕩法（IOS）測(cè)定的各參數(shù)的參考預(yù)計(jì)值及正常值公式，現(xiàn)在臨床沿用的還是歐美國(guó)家（主要是歐洲）提供的正常值范圍，這些預(yù)計(jì)值不一定符合中國(guó)人的實(shí)際，而且國(guó)內(nèi)各地區(qū)在應(yīng)用IOS法做肺功能測(cè)定時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)亦不一致，這樣就不利于對(duì)疾病做出準(zhǔn)確診斷。
　　目的：建立我國(guó)自己的IOS肺功能預(yù)計(jì)值公式，制定出蘭州地區(qū)IOS正常值及預(yù)計(jì)值公式。為蘭州地區(qū)乃至西北五省的臨床醫(yī)生尤其是呼吸科醫(yī)生提供參考，也將為

13、國(guó)內(nèi)其他地區(qū)的臨床醫(yī)生提供一個(gè)線索，為爭(zhēng)取早日建立我國(guó)自己的、統(tǒng)一的預(yù)計(jì)值公式及正常值標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。
　　方法：研究對(duì)象共計(jì)920例，其中女470例，男450例。選擇對(duì)象是：2008年2月至2011年12月在蘭州大學(xué)第二醫(yī)院進(jìn)行體檢的18歲及以上的健康成人；外科非心肺和非氣道疾病擇期手術(shù)的術(shù)前檢查者。研究方法歐洲呼吸學(xué)會(huì)（ERS）推薦的IOS測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)是本研究所采用的檢查方法。檢查前至少24 h內(nèi)未用過膽堿能受體拮抗劑、抗過敏類藥物

14、、茶堿類藥物、β2受體激動(dòng)劑、腎上腺素能受體抑制劑及激素類藥物等。測(cè)定的指標(biāo)包括：IOS參數(shù)、結(jié)構(gòu)參數(shù)圖、頻譜分析圖、阻抗容積圖（Z-V圖）等。其中實(shí)驗(yàn)測(cè)定的IOS的主要參數(shù)為：呼吸總阻抗（Zrs）、中心氣道阻力（R20）、總氣道阻力（R5）、中心阻力（Rc）、周邊阻力（Rp）、周邊粘性阻力（R5-R20）、共振頻率（Fres）及周邊彈性阻力（X5）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　結(jié)果：⑴對(duì)蘭州地區(qū)920例

15、18歲及以上健康成人嚴(yán)格按照歐洲呼吸學(xué)會(huì)（RES）推薦的IOS測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行IOS測(cè)定，IOS參數(shù)Zrs、Fres、R5、R20、X5、Rc、Rp均不呈正態(tài)分布。⑵各參數(shù)正常參考值范圍與目前臨床上一直在采用的國(guó)外提供的正常參考值范圍，二者的配對(duì)t檢驗(yàn)（P＜0.001）有顯著性差異。⑶在蘭州地區(qū)，分別建立了當(dāng)?shù)爻扇私】的行院徒】蹬?IOS主要參數(shù)（Zrs、Fres、R5、R20、X5、）的正常參考值預(yù)計(jì)公式。⑷共振頻率（Fres）均值及9

16、5%可信區(qū)間均大于目前國(guó)內(nèi)外采用的10Hz正常值，甚至大于15Hz，男女相比無(wú)顯著性差異。⑸根據(jù)建立的蘭州地區(qū)健康成人的IOS各參數(shù)的正常參考值預(yù)計(jì)公式，表明粘性阻力（R）主要與體重、身高相關(guān)，與體重呈正相關(guān)，而身高的影響最大，呈負(fù)相關(guān)。⑹在本研究所涉及的年齡范圍內(nèi)（18歲～80歲），IOS各參數(shù)值（除外X5）隨著年齡的增長(zhǎng)無(wú)明顯變化，而X5與年齡成負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論：蘭州地區(qū)健康成人脈沖振蕩（IOS）肺功能各參數(shù)的正常參考值范圍