ATM-ATR阻滯劑對(duì)膠質(zhì)瘤U87化療敏感性的研究.pdf

1、目的:
　　本研究旨在探索ATM/ATR阻滯劑對(duì)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞化療后細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期及修復(fù)通路的影響，尋求提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞化療敏感性的靶點(diǎn)。
　　方法:
　　一、細(xì)胞培養(yǎng)
　　將U87細(xì)胞復(fù)蘇后重懸于含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5％C02的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天換液一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
　　二、實(shí)驗(yàn)分組
　　實(shí)驗(yàn)分為四個(gè)組，分別為空白組，替

2、莫唑胺單藥組，替莫唑胺+KU55933組，替莫唑胺+咖啡因組。替莫唑胺作用時(shí)間分別為24h，48h，72h。KU55933及咖啡因分別于替莫唑胺前1h加入。
　　三、CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性
　　根據(jù)既往文獻(xiàn)及研究結(jié)果，確定替莫唑胺終濃度為50ug/ml，KU55933終濃度為10uM，咖啡因終濃度為100uM。按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行相關(guān)藥物作用后，應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)不同藥物作用后細(xì)胞的存活率。
　　四、Annex in

3、Ⅴ/PI雙染流失細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率
　　根據(jù)流式細(xì)胞術(shù)原理，將待測(cè)U87細(xì)胞以1×106個(gè)/ml接種，按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行干預(yù)，收集細(xì)胞，按照流式凋亡試劑盒處理細(xì)胞。檢測(cè)U87細(xì)胞凋亡情況。
　　五、Wesstern Blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)
　　分析利用儲(chǔ)存-80℃冰箱中的細(xì)胞蛋白做Western blot，測(cè)定chk1，chk2，chk1，chk2，cyclinB，cyclinD1，cleaved-caspase3蛋白

4、的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1、替莫唑胺組細(xì)胞增殖活度較空白組明顯降低，替莫唑胺+KU55933組，替莫唑胺+咖啡因組較替莫唑胺組細(xì)胞增殖活度進(jìn)一步降低，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2、替莫唑胺單藥組較空白組總chk蛋白表達(dá)不變，磷酸化chk升高，cyclinB和cyclinD1表達(dá)上調(diào)，cleaved-caspase3表達(dá)上調(diào)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3、替莫唑胺+KU55933組，替莫唑胺+咖啡因組較替莫唑胺組