肝病患者真菌的感染特點(diǎn)和質(zhì)譜快速鑒定研究.pdf

1、目的:
　　真菌是廣泛分布于自然界的真核生物，已被發(fā)現(xiàn)的約10萬種，其中對(duì)人類具有致病性約300種，不同種真菌的生長特性、臨床特點(diǎn)及耐藥性不同。由于抗菌藥物和免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用、放化療治療的增加、器官移植及介入技術(shù)操作的開展，導(dǎo)致機(jī)體免疫功能低下人群增加，使很多機(jī)會(huì)致病真菌引起感染，成為免疫功能低下患者的重要死亡原因。另外，肝病患者由于蛋白低、單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)受損、白細(xì)胞粘附趨化和吞噬能力降低、腸道內(nèi)菌群失調(diào)等原因成為易感染真菌

2、感染的易感人群，真菌感染的發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢(shì)，引起臨床的高度關(guān)注。同時(shí)，隨著抗真菌藥物的大量應(yīng)用，真菌的耐藥性也日益突出，為臨床的經(jīng)驗(yàn)用藥提出了挑戰(zhàn)?？焖倜鞔_感染真菌的特點(diǎn)及耐藥狀況，成為臨床救治的關(guān)鍵。
　　真菌的特點(diǎn)是生長緩慢，傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定方法所需時(shí)間較長，一般3-7天，且日益多樣化的真菌，使鑒定難度不斷增加均限制了臨床的早期診斷和針對(duì)性治療?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（Matrix-AssistedLase

3、r-Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS）是近年快速發(fā)展起來的一種新興的診斷技術(shù)，可以通過直接檢測(cè)生物標(biāo)志物（蛋白）來鑒定細(xì)菌、分枝桿菌、病毒等，具有快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、成本低的特點(diǎn)。但它對(duì)真菌的鑒定評(píng)價(jià)說法不一，主要原因真菌的細(xì)胞壁厚，前處理方法不成熟導(dǎo)致鑒定結(jié)果的差異。
　　為此本研究通過把質(zhì)譜儀鑒定真菌的結(jié)果與生化鑒定、分子生物學(xué)

4、等技術(shù)鑒定結(jié)果比對(duì)，探索質(zhì)譜技術(shù)快速鑒定真菌的方法，評(píng)價(jià)其真菌鑒定能力，為臨床快速診斷真菌感染提供可靠的依據(jù);同時(shí)對(duì)我院肝病患者真菌感染的臨床資料和藥敏情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，找到肝病患者真菌感染的病原組成特點(diǎn)及增長趨勢(shì)，分析其對(duì)不同種類抗真菌藥物的耐藥性，更好的指導(dǎo)臨床合理的應(yīng)用抗真菌藥物治療，達(dá)到有效控制真菌感染的目的。
　　方法:
　　收集我院2011年-2014年分離自臨床肝病住院患者的2236株真菌的臨床資料（7天內(nèi)分離

5、自同一患者相同部位的真菌不重復(fù)統(tǒng)計(jì)），對(duì)其易感人群、感染部位及菌群分布等特點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用氟康唑、兩性霉素B、伊曲康唑、伏立康唑?qū)?236株真菌進(jìn)行K-B法藥敏試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)分析其耐藥性。用布魯克公司的Microflex型質(zhì)譜儀對(duì)其中327株真菌菌株進(jìn)行快速鑒定，結(jié)果與VITEK-2（酵母樣真菌）和顯微鏡檢查（絲狀真菌）的鑒定結(jié)果比對(duì)，有差異的用分子生物學(xué)方法確認(rèn)鑒定。
　　結(jié)果:
　　從我院近四年肝病患者標(biāo)本分離真菌的情況分

6、析，真菌感染多發(fā)于男性患者，男女比例為1.73∶1，平均年齡為54±14.79歲。肝病患者真菌感染更易發(fā)生在肝硬化失代償期、肝癌及重癥肝炎患者，其中肝硬化失代償期的患者所占比例為69.65％，肝癌患者占16.97％。真菌的分離數(shù)量從2011年的61株，急劇增長到2014年的1222株，增長了19.03倍。四年共分離真菌2236株，酵母樣真菌1889株，占84.48％，絲狀真菌347株，占15.52％;酵母樣真菌的年分離率占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，20

7、11年為63.93％，2012年為85.42％，2013年為84.92％，2014年為85.02％。真菌分離的種類也由2011年的15種增加到了目前的近30種。在眾多真菌種類中，居首的為白假絲酵母菌(52.64％)，其次為熱帶假絲酵母菌(13.86％)和煙曲霉菌(12.03％)。真菌感染部位多發(fā)于呼吸道，占66.41％，其中酵母樣真菌占52.24％，絲狀真菌占14.18％;呼吸道分離的真菌種類以白假絲酵母菌為主，占35.15％，其次為煙

8、曲霉菌占11.09％。腹水和引流液感染是肝病患者真菌感染的特點(diǎn)，分離率為13.91％，感染種類以白假絲酵母菌為主(8.32％)。從我院近四年的真菌藥敏結(jié)果分析，絲狀真菌的耐藥率普遍高于酵母樣真菌(p＜0.05)，酵母樣真菌對(duì)氟康唑、兩性霉素、伊曲康唑和伏立康唑的耐藥率分別為11.96％，2.54％，1.96％和0.69％;絲狀真菌對(duì)氟康唑、兩性霉素、伊曲康唑和伏立康唑的耐藥率分別為95.97％，17.29％，6.05％和4.61％。

9、r>　　本研究對(duì)327株真菌的質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示，依照其評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜儀鑒定酵母樣真菌評(píng)分達(dá)到種水平（評(píng)分＞2.0）的鑒定率為90.31％，達(dá)到屬水平（評(píng)分＞1.7）的為98.68％。絲狀真菌評(píng)分達(dá)到種水平的鑒定率為74％，達(dá)到屬水平的為94％。對(duì)臨床常見的曲霉菌的鑒定正確率可以達(dá)到96.74％。質(zhì)譜儀還能從種內(nèi)對(duì)真菌進(jìn)行更細(xì)致的分型，例如可準(zhǔn)確的將近平滑假絲酵母菌，似平滑假絲酵母菌和擬平滑假絲酵母進(jìn)行區(qū)分。對(duì)單一種類真菌感染的陽性培養(yǎng)瓶，

10、質(zhì)譜從培養(yǎng)瓶中直接提取菌種蛋白鑒定的結(jié)果與培養(yǎng)后用菌落鑒定的結(jié)果相同，這可以把體液真菌感染的鑒定時(shí)間提前24h。本研究通過對(duì)現(xiàn)有各種真菌鑒定方法用時(shí)的比較，發(fā)現(xiàn)質(zhì)譜儀單株菌鑒定用時(shí)僅需20min，并且可同時(shí)檢測(cè)多株菌，是目前真菌鑒定用時(shí)最短，操作也較簡(jiǎn)便的方法，為臨床真菌感染的診斷和治療爭(zhēng)取了時(shí)間。
　　結(jié)論:
　　肝病患者真菌感染的數(shù)量和種類有逐年上升的趨勢(shì)，臨床要特別重視此類患者腹水、引流液等無菌體液的感染，加強(qiáng)對(duì)各種留

11、置管的護(hù)理，對(duì)各種介入性治療要嚴(yán)格無菌操作。應(yīng)根據(jù)微生物實(shí)驗(yàn)室的菌種鑒定和藥敏結(jié)果合理進(jìn)行抗真菌治療，并且要考慮到藥物對(duì)肝臟的毒性，慎重選擇抗真菌藥物。質(zhì)譜儀在鑒定真菌的種屬水平上都達(dá)到了理想的結(jié)果，尤其鑒定酵母樣真菌和曲霉菌的能力更為突出，完全滿足臨床微生物實(shí)驗(yàn)室真菌檢測(cè)的需求。質(zhì)譜儀在真菌感染診斷方面有廣闊的臨床應(yīng)用前景，對(duì)于不常見的真菌，各驗(yàn)室可以根據(jù)自己醫(yī)院患者真菌感染的特點(diǎn)，建立個(gè)性化的數(shù)據(jù)庫，提高真菌檢測(cè)時(shí)效和準(zhǔn)確性，更好的