石蟬草中抵制 JAK-STAT 和 NF-κB 信號通路的裂木脂素類活性成分研究.pdf

1、石蟬草Peperomia blanda Jacq. Kunth(Peperomia dindygulensis Miq.)，胡椒科草胡椒屬一年生肉質(zhì)草本植物，作為傳統(tǒng)的民間中草藥，主要用于肺癌、乳腺癌、肝癌等多種癌癥以及支氣管炎、肺結(jié)核等疾病的治療。植物化學(xué)與分子水平藥理研究表明，石蟬草中的主要抗腫瘤、抗炎活性成分是裂木脂素類化合物。JAK-STAT（Janus kinase-signal transducers and activat

2、ors of transcription）信號通路是近幾十年來國內(nèi)外廣泛研究的與細(xì)胞生長、凋亡以及細(xì)胞免疫相關(guān)的重要的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，多種腫瘤以及自身免疫性疾病常伴隨JAK-STAT信號通路功能的紊亂。因而，JAK-STAT信號通路是近幾十年研究開發(fā)腫瘤和自身免疫性疾病治療新藥的一個(gè)重要靶點(diǎn)。特別是用于治療重度類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的小分子JAK抑制劑Tofaticinib的上市，更加促進(jìn)了該靶點(diǎn)及其抑制劑的研究。NF-κB（Nuclear

3、factor-kappa B）信號通路是與炎癥反應(yīng)及早期的免疫反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，是微循環(huán)障礙、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病以及慢性炎癥相關(guān)腫瘤的重要藥物治療靶標(biāo)。
　　文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，石蟬草中的裂木脂素類化合物尤其是具有2-甲烯基取代的裂木脂素對多種腫瘤細(xì)胞有顯著的生長抑制作用（2-甲烯基取代的裂木脂素還體現(xiàn)了良好抑制炎癥反應(yīng)的活性）。對裂木脂素類化合物抗腫瘤、抗炎活性具體作用機(jī)制的深入研究，以及對裂木脂素類化合物構(gòu)效關(guān)系的探索

4、將有助于闡明石蟬草抗腫瘤、抗炎的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，促進(jìn)此類新藥先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)。
　　通過建立石蟬草乙醇提取物的HPLC分析圖譜，預(yù)測目標(biāo)化合物所對應(yīng)的色譜峰位置以及極性范圍，采用萃取、真空液相色譜（VLC，Vacuum liquid chromatography）、ODS柱層析的方法對目標(biāo)部位進(jìn)行富集、分離，逐步提高目標(biāo)色譜峰對應(yīng)化合物的相對含量，采用硅膠柱層析、ODS柱層析、凝膠柱層析、結(jié)晶、半制備高效液相色譜等方法對這些目標(biāo)色譜

5、峰進(jìn)行分離、純化得到了17個(gè)低含量的化合物，綜合分析質(zhì)譜（ESI-MS、EI-MS）、核磁（1H NMR、13C NMR、HSQC、HMBC、1H,1H COSY、1D-NOE、NOESY）、圓二色光譜（ECD）解析化合物的結(jié)構(gòu)，或與文獻(xiàn)中已知化合物的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)對照確定化合物1～17的平面結(jié)構(gòu)與立體構(gòu)型。
　　確定結(jié)構(gòu)的17個(gè)化合物中，包括7個(gè)新化合物（1～5為裂木脂素，6、7為四氫呋喃木脂素）與10個(gè)已知化合物（8～14為裂木脂素

6、，15、16、17為其他類別化合物），化合物8為新天然產(chǎn)物，化合物15、16、17為本屬植物中首次分離，化合物10、13為石蟬草中首次分離。
　　17個(gè)化合物分別為：(3S)-2-甲烯基-3-[(4'-羥基-3',5'-二甲氧基苯基)(3'',4'',5''-三甲氧基苯基)甲基]丁內(nèi)酯（1），(3S)-2-甲烯基-3-[(3'-羥基-4',5'-二甲氧基苯基)(3'',4'',5''-三甲氧基苯基)甲基]丁內(nèi)酯（2），2-甲基-3

7、-[(3'-羥基-4',5'-二甲氧基苯基)(5''-羥基-3'',4''-亞甲二氧基苯基)甲基]丁內(nèi)酯（3），(2S,3S)-2-甲基-3-[(5'-甲氧基-3',4'-亞甲二氧基苯基)(3'',5''-二羥基-4''-甲氧基苯基)甲基]丁內(nèi)酯（4），(2R,3S)-2-羥甲基-3-[(5'-甲氧基-3',4'-亞甲二氧基苯基)(4''-羥基-3'',5''-二甲氧基苯基)甲基]丁內(nèi)酯（5），(7S,7'S,8R,8'R)-7-(5-

8、甲氧基-3,4-亞甲二氧基苯基)-7'-(4-羥基-3,5-二甲氧基苯基)-8,8'-二羥甲基四氫呋喃（6），(7S,7'S,8R,8'R)-7,7'-雙(4-羥基-3,5-二甲氧基苯基)-8,8'-二乙酰氧甲基四氫呋喃（7），2-甲烯基-3-[雙(3,4,5-三甲氧基苯基)甲基]丁內(nèi)酯（8），(3S)-2-甲烯基-3-[(4'-羥基-3',5'-二甲氧基苯基)(5''-甲氧基-3'',4''-亞甲二氧基苯基)甲基]丁內(nèi)酯（9），2-甲

9、烯基-3-[(5'-甲氧基-3',4'-亞甲二氧基苯基)(3'',4'',5''-三甲氧基苯基)甲基]丁內(nèi)酯（10），草胡椒素E（11），草胡椒素H（12），2,3-反式-2-甲基-3-[(3',4',5'-三甲氧基苯基)(5''-羥基-3'',4''-亞甲二氧基苯基)甲基]丁內(nèi)酯（13），(2S,3S)-2-甲基-3-[(3',4',5'-三甲氧基苯基)(5''-羥基-3'',4''-二甲氧基苯基)甲基]丁內(nèi)酯（14），(+)-(7S

10、,7'S,8R,8'R)-4,4'-二羥基-3,3',5,5'-四甲氧基-7,9',7',9-雙環(huán)氧木脂烷（15），(6R,7E,9R)-9-羥基-4,7-巨豆二烯-3-酮（16）enferamide（17）。
　　本課題組前期從石蟬草中分離得到7個(gè)含量較高的裂木脂素類化合物，分別為：草胡椒素A、草胡椒素B、草胡椒素C、(2S,3S)-2-甲基-3-[(3',4',5'-三甲氧基苯基)(4''-羥基-3'',5''-二甲氧基苯基)

11、甲基]丁內(nèi)酯、(2S,3S)-2-甲基-3-[(3',4'-二羥基-5'-甲氧基苯基)(3'',4'',5''-三甲氧基苯基)甲基]丁內(nèi)酯、(–)-2,3-順式-2-乙酰氧甲基-3-[(5'-甲氧基-3',4'-亞甲二氧基)(4''-羥基-3'',5''-二甲氧基)甲基]丁內(nèi)酯、1,2-反式-2,3-順式-2-乙酰氧甲-3-[(5-甲氧基-3,4-亞甲二氧基苯基)(3,4,5-三甲氧基苯基)甲基]四氫呋喃-1-醇。
　　本次分離得

12、到的12個(gè)裂木脂素與前期分離的7個(gè)裂木脂素按照γ-丁酯環(huán)上C-2位取代基的類型可分為：6個(gè)2-甲烯基取代型裂木脂素，12個(gè)2-甲基取代型裂木脂素，1個(gè)2-羥甲基取代型裂木脂素，1個(gè)2-乙酰氧甲基型裂木脂素以及1個(gè)γ-丁酯環(huán)上羰基被氧化為羥基的裂木脂素。
　　測定這19個(gè)裂木脂素對IFN-γ/STAT1、IL-6/STAT3與TNF-α/NF-κB信號通路的抑制活性，活性測定結(jié)果表明：2-甲烯基取代型裂木脂素對JAK-STAT信號通

13、路具有強(qiáng)的抑制活性（抑制IFN-γ/STAT1和IL-6/STAT3信號通路的IC50分別為1.35~10.53μM、0.59~7.12μM），其中草胡椒素E對JAK-STAT信號通路具有最強(qiáng)的抑制活性（抑制IFN-γ/STAT1和IL-6/STAT3信號通路的IC50分別為1.35μM和0.59μM）。(–)-2,3-順式-2-乙酰氧甲基-3-[(5'-甲氧基-3',4'-亞甲二氧基)(4''-羥基-3'',5''-二甲氧基)甲基]丁

14、內(nèi)酯以及2-甲基-3-[(3'-羥基-4',5'-二甲氧基苯基)(5''-羥基-3'',4''-亞甲二氧基苯基)甲基]丁內(nèi)酯對TNF-α/NF-κB信號通路具有強(qiáng)的抑制活性（IC50分別為2.25μM與3.09μM）。
　　構(gòu)效關(guān)系研究表明：裂木脂素類化合物γ-丁酯環(huán)上的羰基是抑制JAK-STAT信號通路的必需基團(tuán)，內(nèi)酯環(huán)上C-2位被甲烯基取代能大幅度提高裂木脂素對JAK-STAT信號通路的抑制作用，2-甲烯基取代型裂木脂素芳環(huán)上

15、亞甲二氧基的數(shù)目與JAK-STAT信號通路的抑制活性呈正相關(guān)。
　　創(chuàng)新性：
　　1.從石蟬草中分離得到了17個(gè)低含量的化合物，其中包括7個(gè)新的木脂素類化合物（5個(gè)裂木脂素和2個(gè)四氫呋喃木脂素），7個(gè)已知的裂木脂素以及3個(gè)其他類別的化合物。
　　2.分離的12個(gè)裂木脂素的γ-丁酯環(huán)與兩個(gè)芳環(huán)上的取代基具有豐富的結(jié)構(gòu)多樣性，這些化合物包括6個(gè)可能具有高活性的2-甲烯基取代型裂木脂素、1個(gè)2-羥甲基取代型裂木脂素以及5個(gè)2

16、-甲基取代型裂木脂素，進(jìn)一步豐富了本課題組獲得的裂木脂素類化合物的結(jié)構(gòu)類型，為下一步的構(gòu)效關(guān)系研究提供了堅(jiān)實(shí)的化合物基礎(chǔ)。
　　3.首次發(fā)現(xiàn)6個(gè)2-甲烯基取代型裂木脂素對JAK-STAT信號通路具有高抑制活性（對IFN-γ/STAT1與IL-6/STAT3的IC50值均小于10μM，其中最強(qiáng)活性的草胡椒素E抑制IFN-γ/STAT1與IL-6/STAT3的IC50值分別為1.35μM與0.59μM）。部分裂木脂素對TNF-α/NF

17、-κB信號通路具有高抑制活性（(–)-2,3-順式-2-乙酰氧甲基-3-[(5'-甲氧基-3',4'-亞甲二氧基)(4''-羥基-3'',5''-二甲氧基)甲基]丁內(nèi)酯與2-甲基-3-[(3'-羥基-4',5'-二甲氧基苯基)(5''-羥基-3'',4''-亞甲二氧基苯基)甲基]丁內(nèi)酯抑制TNF-α/NF-κB信號通路的IC50值分別為2.25μM與3.09μM）。
　　4.通過構(gòu)效關(guān)系研究，首次發(fā)現(xiàn)γ-丁酯環(huán)上的羰基是裂木脂素抑