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文檔簡介
1、基于PCR的體外誘變法發(fā)展至今，使用的引物從重組PCR法(Recombination PCR)的至少4條引物到大引物PCR法(Megaprimer PCR)的3條引物，再到Quikchange快速突變法(QuikChange Mutagenesis PCR)的2條引物。從至少3輪PCR反應發(fā)展到只需2輪，到Quikchange法及反向PCR法(Inverse PCR)的僅使用一輪PCR反應，步驟越來越簡單，操作越來越簡便，為使用PCR技
2、術進行各種基因克隆操作的科學工作者節(jié)省了大量的時間和精力。 近幾年，有文獻報道使用基于Quikchange原理的方法來制作DNA片段的插入、替代以及刪除突變，但由于QCM-PCR的低產(chǎn)量，難以產(chǎn)生陽性克隆。而采用末端相對的(tail-to-tail)引物設計方法的反向PCR則需要用連接酶連接PCR擴增產(chǎn)物，操作麻煩且陽性率也偏低。 我們實驗室一直在尋找一種簡單高效的可以用于基因的刪除、插入及替代突變的方法，通過大量研究和
3、實驗發(fā)現(xiàn)，可以使用一種基于反向PCR原理，使用全新的引物設計的突變方法--“COP”突變法，該方法采用與QuikChange點突變法相同的操作步驟，其策略是設計一對中心重合(Central overlap)的引物，長引物的5’端序列和3’端序列的Tm值均不低于66℃，短引物Tm值約為長引物一半，且與長引物中心重合互補。這種方法能用于超過20bp的堿基的插入或替代突變，及用于超過2000bp DNA片段的刪除突變的研究。 這種方法
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