五味子醇甲對(duì)高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞舒張功能障礙的保護(hù)作用.pdf

1、目的：體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs），建立高糖損傷模型，用不同濃度的五味子醇甲在高糖刺激前對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，觀察HUVECs的形態(tài)，測(cè)定 RhoA蛋白活性并檢測(cè)內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）的活性及一氧化氮（NO）的分泌水平，探討五味子醇甲對(duì)高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞舒張功能障礙修復(fù)的可能機(jī)制及其干預(yù)作用機(jī)制。
　　方法：選取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株為研究對(duì)象，細(xì)胞傳代12h貼壁后，分為5組：1)正常對(duì)照組：葡萄糖終濃度為5.

2、5mmol/L；2)高糖組：葡萄糖終濃度為30mmol/L；3)高糖+低劑量五味子醇甲組（5μmol/L）；4)高糖+中劑量五味子醇甲組（10μmol/L）；5)高糖+高劑量五味子醇甲組（20μmol/L）。藥物在高糖處理前24小時(shí)加入培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，高糖處理48h后收集細(xì)胞及上清，光鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化；免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)磷酸化肌球蛋白磷酸酯酶靶點(diǎn)亞單位1（p-MYPT1）的表達(dá)水平；RhoA活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定RhoA活性；

3、一氧化氮合酶（NOS）活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定eNOS活性；硝酸還原法測(cè)定NO濃度。
　　結(jié)果：⑴本實(shí)驗(yàn)中GTP-RhoA及p-MYPT1代表了RhoA/Rho激酶被活化。在正常的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中，p-MYPT1以基礎(chǔ)水平表達(dá)在細(xì)胞漿中，經(jīng)過(guò)高糖48h刺激后，細(xì)胞質(zhì)著染棕黃色，表達(dá)信號(hào)明顯增強(qiáng)，不同濃度五味子醇甲預(yù)處理后， p-MYPT1表達(dá)信號(hào)逐漸下降至接近正常水平。Western blotting結(jié)果顯示：正常對(duì)照組可檢測(cè)到少量G

4、TP-RhoA，高糖刺激后GTP-RhoA水平較正常對(duì)照組增加（P<0.01），5μmol/L的五味子醇甲預(yù)處理組與高糖組的GTP-RhoA水平無(wú)顯著差異（P>0.05），而五味子醇甲預(yù)處理組（10μmol/L及20μmol/L）顯著減少了 GTP-RhoA水平（P<0.01），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中20μmol/L的五味子醇甲預(yù)處理組與正常組的GTP-RhoA水平無(wú)明顯差異（P>0.05）。結(jié)果表明：高糖可提高

5、HUVECs的RhoA活性及增加p-MYPT1的表達(dá)，用一定濃度范圍內(nèi)的五味子醇甲對(duì)細(xì)胞預(yù)處理后，可降低RhoA活性，減少p-MYPT1的表達(dá)；⑵與正常對(duì)照組相比，高糖組NO的分泌量及eNOS活性明顯下降，且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）；5μmol/L五味子醇甲預(yù)處理組與高糖組相比較，NO分泌量及eNOS活性均無(wú)明顯差別（P>0.05）；而五味子醇甲預(yù)處理組（10μmol/L和20μmol/L）的NO分泌量及eNOS活性較高糖組明顯升

6、高（ P<0.01），呈藥物濃度依賴(lài)性，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），此外20μmol/L的五味子醇甲預(yù)處理組的NO分泌量及eNOS活性與正常對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果表明：高糖抑制了HUVECs的eNOS活性，減少了NO的分泌，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行五味子醇甲預(yù)處理后，在一定范圍內(nèi)可濃度依賴(lài)地提高高糖損傷后細(xì)胞的eNOS活性，促進(jìn)其分泌NO。
　　結(jié)論：①高糖所致的內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂可能與RhoA/Rho激