免疫調節(jié)藥物(E2以及DMF)在小鼠EAE模型中的治療作用及機制研究.pdf

1、[背景]
　　多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis，MS)是一種常見的中樞神經系統(tǒng)白質脫髓鞘性疾病，其癥狀復雜，多呈反復發(fā)作、進行性加重、高致殘率等特點。目前尚無公認有效的可以阻止復發(fā)進展的治療藥物。雌激素與富馬酸二甲酯作為治療MS的臨床前期藥物其作用機制尚不清楚，本研究選擇雌激素與富馬酸二甲酯兩種治療藥物，通過對實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型進行治療，探討其藥物療效及作用機制。
　　[目的]
　　檢測雌激

2、素和富馬酸二甲酯在小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimentalautoimmune encephalomyelitis，EAE)中的預防性治療作用并初步探討其體內主要靶向T和/或B淋巴細胞的作用機制;另外，體外分離純化小鼠B細胞，分別利用雌激素和富馬酸單甲酯（monomethyl fumarate，MMF）進行處理，探討這兩種藥物對B細胞的可能的調節(jié)作用。
　　[方法]
　　在無菌條件下，將髓鞘少突膠質細胞糖蛋白(

3、MOG35-55)和完全弗氏佐劑(Complete Freud's Adjuvant，CFA)在室溫平衡后按1∶1的比例混合，用自制乳化器乳化至油包水狀態(tài)，經皮下注射（200μl/每只）免疫C57BL/6J小鼠;分別在免疫2h和24h后經腹腔注射PTX（100μl/每只）以制備EAE模型。為了探討雌激素和DMF的預防性治療作用，在免疫小鼠當天，分別經皮下注射雌激素和口服富馬酸二甲酯進行預防性治療。在后續(xù)的觀察過程中，每日于同一時間觀察記

4、錄各組小鼠的發(fā)病情況并給予疾病評分。最后通過疾病發(fā)病指數(shù)評分、脊髓病理分析，并應用流式細胞儀(FACS)及實時熒光定量PCR(Q-PCR)等方法檢測炎癥因子（TNF-α和IL-17A）水平對治療效果進行評價;進一步通過流式細胞術分析小鼠脾臟多種免疫細胞CD4/PD-1，CD19/PD-L1，CD4/CD25/Foxp3,CD19/CD21/CD23以及CD19/CD5/CD1dhi以及脊髓中相關功能分子的表達變化，探討雌激素和富馬酸二甲

5、酯可能的作用機制，并通過體外實驗進一步研究雌激素與Breg及PD-1/PD-L1信號通路的關系，探討MMF通過調節(jié)趨化因子和黏附分子表達作用于EAE小鼠的可能作用機制。
　　[結果]
　　1、成功構建EAE模型小鼠，發(fā)病小鼠神經功能損害癥狀、LFB染色均符合典型EAE模型的病理和臨床特征。
　　2、雌激素治療后可有效延緩EAE小鼠的發(fā)病進程，減輕脫髓鞘水平以及脊髓炎性細胞浸潤，并下調外周炎癥因子TNF-α以及IL-17

6、A的分泌表達。
　　3、雌激素治療可下調T淋巴細胞表面活化分子CD69的表達，但與模型對照組相比無顯著性差異;另一方面，雌激素治療可顯著上調CD4+T細胞表面PD-1以及CD19+B細胞表面PD-L1的表達，并顯著上調脾細胞中CD19+CD21 hiCD23low以及CD19+CD5+CD1dhi的比例，但對脾細胞中CD4+CD25+Foxp3+的表達無明顯作用。
　　4、體外結果表明，雌激素能誘導B細胞分泌表達IL-10，

7、上調IL-10+Breg細胞比例，并能夠上調PD-L1的表達及RBM47的蛋白水平。
　　5、DMF治療能夠緩解EAE小鼠的發(fā)病水平，減輕脊髓脫髓鞘水平及脊髓炎性細胞的浸潤。
　　6、體外結果表明，MMF可上調B細胞的IL-10及PD-L1的表達水平，并顯著下調黏附分子VCAM-1及趨化因子CXCL9的表達。
　　[結論]
　　1、雌激素和富馬酸二甲酯預防性治療可延緩EAE小鼠的發(fā)病進程，對EAE起到一定治療作用