2型糖尿病（消渴）從“脾”論治理論探討與實驗研究.pdf

1、2型糖尿病(Type2 Diabetes mellitus，T2DM)是由多種病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝紊亂性疾病，屬于中醫(yī)“消渴病”范疇?，F(xiàn)代醫(yī)學認為T2DM同時伴有因胰島素分泌或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)異常代謝，胰島細胞功能缺陷和胰島素抵抗是T2DM的兩大病理生理基礎。
　　目的:
　　本研究提出從“脾”論治消渴(T2DM)的學術觀點，采用“運脾津”治則指導下研制的藥物津力達顆粒作為藥物干預，通過建立T2D

2、M大鼠模型，觀察糖尿病胰島功能病變特征及津力達顆粒的干預作用及機制;高脂飲食誘導建立胰島素抵抗大鼠模型，觀察津力達顆粒對糖脂代謝及胰島素敏感性的干預作用及機制;建立軟脂酸誘導的INS-1細胞損傷模型，觀察津力達顆粒對INS-1細胞的保護機制。通過上述整體動物和離體細胞實驗研究，以期為消渴(T2DM)的治療提供有效方法與方藥，同時也為消渴病從“脾”論治提供實驗支持。
　　方法:
　　本研究分為以下兩部分內(nèi)容:
　　理論研

3、究方法:本文系統(tǒng)梳理消渴病病名、病因、病機和治療的歷史源流，探析近代醫(yī)家張錫純提出的消渴“起于中焦而極于上下”理論及臨證應用，從“脾”立論，提出“脾失健運、水谷津液代謝異常”是消渴病主要病機，“脾失健運、痰瘀阻絡”是消渴病引發(fā)全身并發(fā)癥主要病機，確立“運脾津”治則并綜合治脾諸法:益脾氣、養(yǎng)脾陰、燥脾濕、泄脾熱、溫脾陽、暢脾氣、通脾絡，形成津力達顆粒組方，分析津力達顆粒組方特點及其臨床及實驗研究進展，以期為消渴病治療提供有效治法與方藥。<

4、br>　　實驗研究方法:
　　1.津力達顆粒對T2DM大鼠胰島功能干預作用研究
　　90只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、吡格列酮組(4.5mg/kg體重)和津力達低、中、高劑量組（0.75、1.5、3.0g/kg體重），每組15只，除正常組外，其余各組予高脂飼料喂養(yǎng)。喂養(yǎng)6周后，腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)(30mg/kg)誘導T2DM模型，72h后血糖儀測定空腹血糖≥13.9mmol/L為模型成功，不符合標準者剔除。造模

5、成功后給藥6周，正常組和模型組給予等體積純水灌胃。造模后除正常組外，其余各組繼續(xù)予高脂飼料喂養(yǎng)。末次給藥后禁食12h，10％水合氯醛麻醉，腹主動脈取血分離血清，全自動生化儀檢測空腹血糖(FBG)、放射免疫法檢測空腹胰島素(FINS)以計算胰島β細胞功能指數(shù)(HOMA-β);透射電鏡觀察各組大鼠胰島β細胞超微結構變化;Westernblot方法檢測胰腺組織胱天蛋白酶3(Casepase3)、自噬相關蛋白(p62、Atg7、LC3Ⅰ、LC3

6、Ⅱ、Beclin-1)蛋白表達;免疫組織化學方法觀察胰島細胞自噬相關蛋白Beclin-1表達。
　　2.津力達顆粒對胰島素抵抗大鼠糖脂代謝及胰島素敏感性干預作用研究
　　動物分組同上，每組10只，除正常組外，其余各組予高脂飼料喂養(yǎng)6周，行口服糖耐量實驗判斷動物是否造模成功，模型組空腹血糖＜13.9mmol/L、每個時間點血糖高于正常組且AUC面積與正常組有統(tǒng)計學差異，評價為模型成功。造模成功后給藥6周，正常組和模型組給予等體

7、積純水灌胃。造模后除正常組外，其余各組繼續(xù)予高脂飼料喂養(yǎng)。末次給藥后禁食12h，10％水合氯醛麻醉，腹主動脈取血分離血清，檢測FBG、FINS，計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR);全自動生化儀檢測總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、游離脂肪酸(FFA);油紅O染色觀察各組大鼠肝臟細胞脂滴沉積情況;透射電鏡觀察各組大鼠肝臟細胞超微結構變化;ELISA法檢測血清大鼠血清抵

8、抗素(Resistin)、白介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α（TNFα）水平;Western blot檢測肝臟細胞糖脂代謝相關通路(AMPK/ACC通路)中p-AMPK、AMPK、p-ACC、ACC蛋白表達、胰島素信號相關通路(PI3K/Akt通路)中p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、GLUT4蛋白表達。
　　3.津力達顆粒對軟脂酸(PA)誘導的INS-1細胞損傷的干預作用研究
　　體外培養(yǎng)INS-1細胞，以CC

9、K-8方法檢測不同濃度（100，200，300，400μg/mL）JLD對INS-1細胞生存活性的影響以判定津力達對細胞是否具有毒性;給予最適濃度JLD4h后，加入PA共同處理細胞24 h，CCK-8方法檢測細胞活性，RT-PCR方法檢測細胞凋亡相關蛋白(BAX、Bcl-2)、Atg7、Beclin-1基因表達;以CompoundC處理細胞，檢測其對PA損傷下INS-1細胞p62基因表達的影響。
　　結果:
　　1.津力達顆

10、粒對2型糖尿病(T2DM)大鼠胰島功能干預作用研究結果:生化檢測結果顯示，與正常組比較，模型組血糖升高、胰島素水平降低，胰島β細胞功能指數(shù)降低(P＜0.01）用藥組空腹血糖降低、空腹血清胰島素水平及血清胰島β細胞功能指數(shù)水平升高，其中津力達中、高劑量組與模型組比較具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，P＜0.01);電鏡結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠胰島β細胞超微結構損傷，各用藥組大鼠胰島β細胞超微結構損傷改善，胰島β細胞病變減輕;West

11、ernblot結果顯示，與正常組比較，模型組凋亡相關蛋白Casepase3表達增加，自噬相關蛋白p62、LC3Ⅰ蛋白表達增加、Atg7、LC3Ⅱ蛋白表達降低(P＜0.05，P＜0.01);與模型組比較，用藥組Casepase3表達降低，p62、LC3Ⅰ蛋白表達降低、Atg7、LC3Ⅱ蛋白表達升高(P＜0.05);免疫組化結果均顯示，與正常組比較，模型組中胰島β細胞自噬相關蛋白Beclin-1表達減少，與模型組相比，JLD組Beclin-

12、1表達增加，Westernblot結果顯示變化趨勢與免疫組化結果相同，且具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　2.津力達顆粒對胰島素抵抗大鼠糖脂代謝及胰島素敏感性干預作用研究結果:
　　生化檢測結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠血清TC、TG、LDL-C、FFA水平顯著升高，HDL-C水平顯著下降(P＜0.01)。與模型組比較，津力達低劑量組對FFA的調(diào)整作用具有統(tǒng)計學意義，津力達中、高劑量組對TC、TG、FFA的調(diào)整作用具

13、有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，P＜0.01)。胰島素抵抗指數(shù)檢測顯示，實驗末模型組大鼠HOMA-IR升高(P＜0.01)，與模型組比較各用藥組HOMA-IR降低，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，P＜0.01);油紅O染色與電鏡結果顯示，模型組大鼠肝臟細胞中出現(xiàn)大量脂滴、肝細胞結構損傷，各用藥組肝細胞內(nèi)月旨滴減少，大鼠肝細胞超微結構損傷改善。ELISA結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠血清Resistin、IL6、TNFα水平升高（P＜0.0

14、1），與模型組比較，津力達中高劑量組Resistin、TNFα水平降低，津力達高劑量組IL6水平降低，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05,P＜0.01)。Western blot結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠肝臟p-ACC、p-AMPK蛋白表達降低(P＜0.01）;與模型組比較，用藥組肝臟p-ACC、p-AMPK表達增加(P＜0.01);與正常組比較，模型組大鼠肝臟p-PI3K、p-Akt、GLUT4表達降低，用藥組大鼠肝臟p-PI3K、

15、p-Akt、GLUT4表達增加，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01）。
　　3.津力達顆粒對軟脂酸(PA)誘導的INS-1細胞損傷的干預作用研究結果:
　　CCK-8結果顯示，津力達各用藥劑量組細胞較正常組細胞生存活性無統(tǒng)計學差異;PA損傷后INS-1細胞生存活性降低，BAX、Atg7、Beclin-1基因表達增加，Bcl-2基因表達降低(P＜0.01），用藥后，細胞生存活性增加(P＜0.01)，細胞BAX基因表達減少，Bcl-2

16、、Atg7、Beclin-1基因表達增加;CompoundC能阻斷PA環(huán)境下津力達對p62基因表達的調(diào)節(jié)作用(P＜0.01)。
　　結論:
　　1.理論研究:本研究基于近代名醫(yī)張錫純《醫(yī)學衷中參西錄》提出的“消渴一證，古有上中下之分，謂其證皆起于中焦而極于上下”學術思想，在系統(tǒng)整理研究歷代醫(yī)家關于消渴病病名、病因、病機及治療研究基礎上，提出從“脾”論治消渴學術觀點，指出機體水液代謝與輸布、飲食精微轉輸與利用的紊亂及不平衡狀態(tài)

17、為其發(fā)病之關鍵，提出“脾失健運、水谷津液代謝異常”是消渴病主要病機，“脾失健運、痰瘀阻絡”是消渴病引發(fā)全身并發(fā)癥主要病機，確立“運脾津”治則并綜合治脾諸法:益脾氣、養(yǎng)脾陰、燥脾濕、泄脾熱、溫脾陽、暢脾氣、通脾絡，并據(jù)此形成滓力達顆粒組方，為消渴病(T2DM)臨床防治研究開辟了有效途徑和藥物。
　　2.實驗研究:體內(nèi)實驗表明，津力達顆粒有效調(diào)節(jié)T2DM大鼠血糖及胰島素分泌，保護β細胞結構，維持胰島功能，減少胰島細胞凋亡，保護胰島細胞

18、數(shù)量。同時調(diào)整胰島素抵抗大鼠糖脂代謝，調(diào)節(jié)血清脂肪因子及炎癥因子，減輕肝臟脂質(zhì)沉積，改善胰島素敏感性，其機制可能與調(diào)節(jié)AMPK/ACC及PI3K/Akt信號通路有關。體外實驗證實，津力達顆粒改善軟脂酸誘導的INS-1細胞損傷，增加其生存活性，激活其自噬，機制可能與激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)相關通路有關。
　　通過以上實驗研究佐證了消渴從“脾”論治的科學價值，驗證了津力達在改善胰島素抵抗、治療T2DM方面的確切作用，為臨床治