ABCA1-ABCB1-ABCC1三條基因抗砷作用的研究.pdf

1、目的：在前期研究證實ABCA1基因具有抗砷功能的基礎上，本課題按析因設計的要求，利用RNA干擾技術將ABCA1基因與已明確具有抗砷作用的ABC家族ABCB1（MDR1）、ABCC1（MRP1）基因，分別采用單一基因抑制、兩個聯合抑制、和三者同時抑制的方法，通過檢測目的基因阻斷前后，抗砷細胞ECV304對急性砷毒性耐受性變化和細胞內砷含量的改變，進一步確定ABCA1基因的功能及其在抗砷過程中與ABCB1、ABCC1基因有否交互作用，并推測

2、可能的抗砷機制。 方法：采用析因設計的實驗法，將化學合成的ABCA1、ABCB1、ABCC1基因的特異性siRNA在siPORTMNeoFX TM轉染劑的介導下，轉染抗砷細胞ECV304，實時熒光定量PCR（real-time PCR）方法檢測轉染后目的基因mRNA水平；蛋白質免疫印記法（Western-blot）檢測轉染后目的基因蛋白水平。通過CCK8法檢測48h急性砷染毒后光密度值（OD）值，計算生存率及半數抑制濃度（IC

3、50），反應細胞抗砷性的變化，用原子熒光分光光度法（AFS）檢測細胞內砷蓄積量的變化。 結果：Real-time PCR結果顯示所有標本的管家基因Actin和目的基因均可見較標準的擴增曲線，無非特異擴增?？股榧毎D染siRNA-ABCA148小時的Real-time PCR檢測，實驗組細胞中ABCA1的表達量較陰性對照組明顯降低（P<0.05），而陰性對照組與未轉染的抗砷細胞ABCA1表達量無明顯差異（P>0.05），且siR

4、NA-ABCA1濃度為80nM時的干擾效率為90.3±1.98％；同樣篩選出siRNA-ABCB1和siRNA-ABCC1干擾效率在91.2±1.03％和90.7±2.63％時的濃度分別為20nM和40nM，并認為三者的干擾效率一致。Western-blot結果顯示抗砷細胞在轉染三條目的基因siRNA后，實驗組、陰性對照組及未轉染組在相應目的蛋白Marker處均有特異性蛋白條帶，其大小與目的蛋白大小相符，且實驗組相應目的蛋白表達量明顯低

5、于陰性對照組及未轉染組。依此濃度將三對siRNA-ABCA1，siRNA-ABCB1，siRNA-ABCC1分別按析因設計轉染抗砷細胞，Wetern-blot檢測相應目的蛋白呈低表達，急性砷染毒48h用CCK8法計算生存率及IC50，經析因設計方差分析結果顯示實驗組細胞在各砷濃度下生存率均低于同步對照組細胞，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。干擾ABCA1，ABCB1，ABCC1，ABCA1+ABCB1，ABCA1+ABCC1，ABCB

6、1+ABCC1，ABCA1+ABCB1+ABCC1基因后，細胞的IC50分別為（5.68±0.018，6.38±0.05，4.87±0.071，5.46±0.129，5.15±0.085，4.94±0.51，4.08±0.066）μmol/l明顯低于對照組IC50（12.2±0.08，12.08±0.35，12.14±0.74，12.23±1.2，12.03±1.92，12.15±0.57，12.07±1.48）μmol/l，并且三條基

7、因聯合抑制的抗砷細胞在各砷濃度的生存率與ECV304相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。AFS檢測結果顯示，4h，6h，8h，10h實驗組細胞內砷含量均高于同步對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），三條基因同時干擾時，細胞砷含量明顯增加，并且在6，8，10小時與ECV304細胞內砷蓄積量相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。 結論：我們的結果表明：ABCA1、ABCB1、ABCC1三條基因均是重要抗砷基因，其主要的抗