Foxp3在宮頸癌表生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中作用研究.pdf

1、目的：
　　宮頸癌是嚴(yán)重危害婦女生命健康的惡性生殖道腫瘤。在發(fā)展中國(guó)家，宮頸癌的發(fā)病和病死率均居第二位，并有年輕化傾向。人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)持續(xù)感染已被證實(shí)作為宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的第一要素。宿主免疫反應(yīng)，特別是細(xì)胞免疫反應(yīng)，對(duì)控制HPV感染及HPV相關(guān)腫瘤形成發(fā)揮重要作用。Treg細(xì)胞是一種免疫負(fù)性調(diào)控細(xì)胞，可以通過(guò)與細(xì)胞直接接觸和分泌抑制性細(xì)胞因子發(fā)揮免疫抑制作用。Treg

2、細(xì)胞對(duì)于維持宿主免疫系統(tǒng)對(duì)自身抗體的免疫無(wú)應(yīng)答性和抑制過(guò)度的免疫反應(yīng)對(duì)宿主造成損傷起著不可或缺的作用;另一方面，Treg細(xì)胞打破體內(nèi)平衡過(guò)表達(dá)可能會(huì)阻礙機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)感染及腫瘤的保護(hù)性免疫反應(yīng)，幫助腫瘤細(xì)胞逃逸免疫系統(tǒng)的殺傷而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。
　　CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞具有廣泛的免疫抑制性，通過(guò)表面膜分子與其它細(xì)胞直接接觸或以分泌抑制性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β等方式，抑制體內(nèi)CD4+Th1細(xì)胞等多種免疫細(xì)

3、胞的活化和增殖。多種T細(xì)胞分子抗原參與Treg的特異性功能效應(yīng)，F(xiàn)oxp3是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞特異性的表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)Treg細(xì)胞的發(fā)育和功能發(fā)揮具有關(guān)鍵作用，特別是Foxp3高表達(dá)的Treg具有顯著的免疫抑制效應(yīng)。Tregs功能紊亂（例如，F(xiàn)oxp3基因突變）能夠引起嚴(yán)重的自身免疫免疫性疾病，免疫病理學(xué)及變態(tài)反應(yīng)。Foxp3是來(lái)源于胸腺以及外周的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的標(biāo)志性分子。Foxp3雖然在除胸腺和脾以外的組織中有較少程度的表達(dá)，最新發(fā)現(xiàn)Fox

4、p3可以表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞，并且與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后具有一定的關(guān)系。p16INK4a是HPV整合入宿主細(xì)胞的主要標(biāo)志。p16INK4a的異常表達(dá)和HR-HPV感染關(guān)系密切， HPV DNA整合到宿主染色體DNA上是病毒在體內(nèi)穩(wěn)定存在并維持持續(xù)感染的重要形式。p16INK4a與Foxp3之間關(guān)系有待進(jìn)一步研究。
　　目前關(guān)于Foxp3在宮頸腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響尚未見報(bào)道。本課題旨在研究Foxp3在宮頸癌組織中的表達(dá)作用

5、情況，比較其與宮頸癌臨床病理特征以及其與p16INK4a的關(guān)系;Foxp3的表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖及侵襲能力的影響及機(jī)制，為尋找宮頸癌治療提供新思路。
　　方法：
　　1、應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)宮頸癌97例、CIN31例和正常宮頸組織20例中Foxp3、p16INK4a蛋白的表達(dá)，并探討其與宮頸癌臨床分期、病理分化類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、等臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。探討Foxp3、p16INK4a與血清鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)抗原水平，

6、HPV感染狀態(tài)的相關(guān)性，以及Foxp3與p16INK4a二者在宮頸癌中的相關(guān)性。
　　2、應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞中Foxp3的表達(dá);建立Foxp3沉默細(xì)胞系;Western blot方法及Real-time PCR檢測(cè)基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中Foxp3、p16INK4a蛋白和mRNA的表達(dá);CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性;Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力;細(xì)胞周期方法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力;細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Foxp3對(duì)

7、細(xì)胞凋亡的影響。
　　3、應(yīng)用免疫磁珠分離法(MACS)分離、純化CD8+CTL及CD4+CD25+Treg細(xì)胞，建立CD8+CTL細(xì)胞特異性殺傷宮頸癌Siha細(xì)胞體系。MTT檢測(cè)共培養(yǎng)時(shí)Siha細(xì)胞的活性及ELISA檢測(cè)共培養(yǎng)體系上清液的細(xì)胞因子（IL-10，TGF-β）。
　　結(jié)果：
　　一、Foxp3、p16INK4a在宮頸癌組織中表達(dá)
　　正常宮頸上皮組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌組織中的Foxp3、p16

8、INK4a表達(dá)逐漸增高，三者間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。宮頸癌組織中Foxp3、p16INK4a表達(dá)水平與宮頸癌的FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小及HPV感染狀態(tài)有關(guān)(P＜0.05）。但是與患者年齡、宮頸癌的分化程度及病理分化類型之間無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　二、Foxp3對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖及侵襲能力的影響
　　沉默F(xiàn)oxp3基因的Siha細(xì)胞Foxp3、p16INa蛋白、基因的表達(dá)明顯低于空白及陰性對(duì)照組;CC

9、K-8結(jié)果顯示，沉默F(xiàn)oxp3基因的Siha細(xì)胞增殖能力受到抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默F(xiàn)oxp3的Siha細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯低于空白及陰性對(duì)照組;細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示，沉默F(xiàn)oxp3的Siha細(xì)胞中處于S、G2期的細(xì)胞數(shù)目明顯低于空白及陰性對(duì)照組;細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，沉默F(xiàn)oxp3的Siha細(xì)胞的凋亡細(xì)胞數(shù)明顯高于空白及陰性對(duì)照組。
　　三、CD4+CD25+Treg細(xì)胞對(duì)建立CTL細(xì)胞特

10、異性殺傷宮頸癌Siha細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用
　　采用MACS CD8+positive selection/CD25+positive selection的方法可以獲取CD8+細(xì)胞和CD4+CD25+Treg細(xì)胞。在體外殺瘤體系中，加入CD4+CD25+Treg細(xì)胞，可抑制CD8+CTL細(xì)胞對(duì)Siha宮頸癌細(xì)胞的殺傷作用，通過(guò)將D4+CD25+Treg細(xì)胞與CD8+CTL分隔培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，分隔培養(yǎng)的CD8+CTL細(xì)胞對(duì)Siha宮頸癌細(xì)胞

11、的殺傷作用明顯強(qiáng)于共同培養(yǎng)的CD8+CTL細(xì)胞。共培養(yǎng)體系中上清液中IL-10，TGF-β差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1、Foxp3、p16INK4a表達(dá)隨著宮頸病變的進(jìn)展逐漸增高。提示Foxp3、p16INK4a的表達(dá)增高可能是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一。Foxp3陽(yáng)性表達(dá)率與宮頸癌的FIGO分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及HPV相關(guān)，提示Foxp3表達(dá)上調(diào)與宮頸癌的不良預(yù)后相關(guān)。
　　2、沉默F(xiàn)oxp3基因能夠顯著抑制宮頸