急性低氧暴露對棕色田鼠腦組織p53基因表達(dá)的影響.pdf

1、地下鼠（subterranean rodents）除了耐低氧（hypoxia）、高二氧化碳（carbon dioxide）和對黑暗環(huán)境（dark environment）的適應(yīng)等特性外，大多還具有抗腫瘤的特性，例如，裸鼴鼠（Heterocephalus glaber）和盲鼴形鼠（Spalax）均具有很強(qiáng)的腫瘤抑制（tumor suppressor）特性。有關(guān)地下鼠抗腫瘤的分子生物學(xué)研究，主要集中于腫瘤抑制基因（tumor suppres

2、sor gene）p53及其調(diào)控的分子通路方面。p53基因可誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯（cell cycle arrest），并修復(fù)受損的DNA或促進(jìn)細(xì)胞凋亡（apoptosis）。無論DNA修復(fù)還是細(xì)胞凋亡，均可降低低氧對地下鼠重要組織（例如腦組織）的傷害。上述兩條通路被認(rèn)為是地下鼠腫瘤抑制的分子調(diào)控通路，受低氧或者DNA損傷的誘導(dǎo)。
　　本論文通過在形態(tài)學(xué)、組織學(xué)以及分子生物學(xué)方面，采用比較生物學(xué)方法，以棕色田鼠（Lasiopodomy

3、s mandarinus）為實驗動物，布氏田鼠（Lasiopodomys brandtii）為實驗對照，確定個性化與體重變化的關(guān)系、腦組織海馬區(qū)CA1區(qū)域細(xì)胞凋亡和腫瘤抑制基因p53和HIF-1a的表達(dá)情況，旨在探索棕色田鼠腫瘤抑制的分子生物學(xué)機(jī)制。主要結(jié)果如下：
　　1.急性低氧暴露后復(fù)氧對體重變化的影響
　　采用視頻自動分析軟件Smart3.0，測定24只棕色田鼠和24只布氏田鼠的個性化（personality），選擇其

4、中個性化得分在0.2-0.6的24只個體（棕色田鼠和布氏田鼠各12只）作為實驗動物，用于復(fù)氧后體重變化的實驗?？芍貜?fù)測量的雙因素方差分析（repeated measurements ANOVA）結(jié)果表明，1）無論是在低氧還是在常氧處理下，棕色田鼠和布氏田鼠的體重變化趨勢相似。即棕色田鼠低氧組、棕色田鼠常氧組、布氏田鼠低氧組、布氏田鼠常氧組等4組動物的體重均呈現(xiàn)先降低后恢復(fù)的現(xiàn)象（P=0.015），低氧暴露顯著地降低了兩種鼠的體重（P=0

5、.038），而鼠種之間（P=0.956）或者鼠種與低氧處理間的交互作用（P=0.394）則均不顯著。2）棕色田鼠和布氏田鼠的體重變化與其個性化得分間相關(guān)性不顯著（棕色田鼠：y=3.5195x-11.672，R2=0.0373，P=0.71；布氏田鼠：y=0.6768x-8.3354，R2=0.0041，P=0.91），說明實驗中選擇動物的個性化范圍較好，低氧處理對兩種鼠的作用強(qiáng)度相近，能夠很好用于后續(xù)組織學(xué)和分子生物學(xué)的研究。
　

6、　2.急性低氧暴露后復(fù)氧對p53和HIF-1α基因表達(dá)的影響
　　通過提取18只棕色田鼠和18只布氏田鼠腦組織總RNA、反轉(zhuǎn)錄成cDNA、獲取序列、設(shè)計引物、引物驗證、與相近物種多序列比對、構(gòu)建進(jìn)化樹，以及對物種間HIF-1α和p53的表達(dá)量比較，并且應(yīng)用相對定量法，以β-actin為管家基因?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行分析。雙因素方差分析結(jié)果表明，1）不同復(fù)氧時間對棕色田鼠和布氏田鼠的HIF-1α表達(dá)量的影響達(dá)到極顯著差異（P<0.01），兩種鼠

7、的HIF-1α表達(dá)量均呈現(xiàn)先上升后波動下降恢復(fù)的現(xiàn)象。鼠種和不同復(fù)氧時間的交互作用達(dá)到極顯著差異（P=0.002），鼠種之間的HIF-1α表達(dá)量達(dá)到極顯著差異（P=0.003）。2）棕色田鼠HIF-1α出現(xiàn)的時間晚于布氏田鼠，兩種鼠HIF-1α表達(dá)量在復(fù)氧12 h達(dá)到高峰，說明低氧暴露后布氏田鼠腦組織較快呈現(xiàn)缺氧狀態(tài)，兩鼠均在復(fù)氧12 h時腦組織表現(xiàn)為高度缺氧。3）不同復(fù)氧時間對棕色田鼠和布氏田鼠的p53表達(dá)量的影響達(dá)到極顯著差異（P<

8、0.01），棕色田鼠的p53表達(dá)量先呈上升趨勢，在復(fù)氧12h時p53表達(dá)量達(dá)到高峰，然后呈下降趨勢，而布氏田鼠 p53表達(dá)量在整體上沒有變化趨勢。鼠種和不同復(fù)氧時間的交互作用達(dá)到極顯著差異（P<0.01），鼠種之間無顯著差異（P=0.996）。4）棕色田鼠HIF-1α表達(dá)量與p53表達(dá)量之間存在極顯著的正線性關(guān)系（r=0.836，P<0.01），說明腦內(nèi)缺氧可以誘導(dǎo)p53的表達(dá)。
　　3.急性低氧暴露后復(fù)氧對海馬區(qū)CA1細(xì)胞的影響

9、
　　選擇18只棕色田鼠和18只布氏田鼠作為實驗動物，采用TUNEL法染色、倒置顯微鏡觀察，選用腦組織海馬區(qū)CA1區(qū)域做石蠟切片，并在40×10的放大倍數(shù)下，對凋亡細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。雙因素方差分析結(jié)果表明，1）不同復(fù)氧時間對棕色田鼠和布氏田鼠腦組織海馬區(qū)細(xì)胞凋亡的影響達(dá)到極顯著差異（P<0.01），棕色田鼠和布氏田鼠的凋亡細(xì)胞均呈現(xiàn)先上升后下降恢復(fù)的現(xiàn)象。鼠種和不同復(fù)氧時間之間的交互作用達(dá)到極顯著差異（P<0.01），但是鼠種之間未有

10、顯著差異（P=0.898）。2）棕色田鼠凋亡指數(shù)在復(fù)氧24 h達(dá)到高峰，布氏田鼠凋亡指數(shù)在復(fù)氧12h達(dá)到高峰，說明棕色田鼠凋亡高峰出現(xiàn)的時間晚于布氏田鼠，低氧脅迫對布氏田鼠的影響較早，損傷時間較早。3)棕色田鼠HIF-1α和凋亡細(xì)胞呈極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系（P=0.008），說明低氧誘導(dǎo)因子可以棕色田鼠抑制細(xì)胞凋亡；布氏田鼠 HIF-1α和凋亡細(xì)胞呈極顯著的正線性關(guān)系（y=0.1503x-0.0508，R2=0.3945，P=0.005），