高壓氧治療對慢性應(yīng)激大鼠的影響.pdf

1、背景：
　　慢性應(yīng)激(chronic stress)指的是機(jī)體長時(shí)間持續(xù)或間斷暴露于應(yīng)激源中，也就是日常生活工作中所存在的壓力。長期應(yīng)對壓力刺激將造成人體的失代償，全身功能失調(diào)，特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)功能低下，由此導(dǎo)致和（或）促進(jìn)多種疾病的發(fā)生，嚴(yán)重影響人們的生活及工作質(zhì)量。目前已經(jīng)明確，慢性應(yīng)激是多種心理疾病如抑郁癥及創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙的病因之一，同時(shí)也是心腦血管疾病發(fā)生的一個(gè)中度危險(xiǎn)因素。
　　據(jù)報(bào)道，

2、在美國慢性應(yīng)激發(fā)生率約為50％，其中的25％為高強(qiáng)度的應(yīng)激。而國內(nèi)城市中慢性應(yīng)激的發(fā)生率為42％～46％。近些年我們收治了大量突發(fā)性耳聾、神經(jīng)性耳鳴、腦血管病的病人，其中有很大一部分存在生活、工作上的壓力。這些患者初期往往出現(xiàn)心率、血壓、血糖、血脂等指標(biāo)的變化，后期出現(xiàn)各種器質(zhì)性疾病，更有甚者發(fā)生嚴(yán)重的心、腦等嚴(yán)重不良事件。
　　目前國內(nèi)外慢性應(yīng)激相關(guān)的研究大部分都集中在其致病機(jī)制上，而針對治療方面的研究則相對薄弱。目前臨床主要的

3、干預(yù)方式為藥物及心理干預(yù)上，但是它們或是副作用或花費(fèi)過大等問題難以在大眾中推廣。
　　高壓氧治療慢性器官或臟器缺血有特殊的效果，據(jù)白永杰等的介紹高壓氧治療的作用包括:提高人體內(nèi)的氧分壓、氧氣的彌散距離、刺激側(cè)枝循環(huán)的形成、抑制炎癥反應(yīng)等。在臨床中我們發(fā)現(xiàn)，對于一些存在慢性應(yīng)激的病人，經(jīng)過一段時(shí)間的高壓氧治療后，發(fā)現(xiàn)這部分病人的主觀癥狀，特別是因壓力而來的輕度抑郁、焦慮狀態(tài)有所減輕。我們設(shè)想高壓氧治療可能具有緩解慢性應(yīng)激對機(jī)體損害的

4、能力。
　　為此我們設(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)，通過觀察高壓氧治療對慢性應(yīng)激處理大鼠各種生理指標(biāo)的影響，探索高壓氧治療干預(yù)慢性應(yīng)激的可行性。
　　目的：
　　通過觀察慢性應(yīng)激和高壓氧處理對Wistar大鼠體重、心率變異度、行為學(xué)、血清HPA軸激素水平、一氧化氮系統(tǒng)、TNF-α以及海馬糖皮質(zhì)激素受體表達(dá)的情況，探討:(1)高壓氧對動物慢性應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響;(2)慢性束縛是否能模擬動物慢性應(yīng)激的生理狀態(tài);(3)高壓氧治療能否減輕慢性束

5、縛對機(jī)體帶來的影響。為此我們設(shè)計(jì)了本課題，旨在為高壓氧治療作為慢性應(yīng)激的干預(yù)手段提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　材料與方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)材料
　　1.1 實(shí)驗(yàn)動物:選取健康雄性8月齡Wistar大鼠60只，體重200～250g，大鼠分籠飼養(yǎng)，5只/籠，飼養(yǎng)室內(nèi)溫度恒定于25～28℃，濕度50～60％，12h/d光照，給予自由進(jìn)食飲水，墊料隔日更換。實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。
　　1.2 高壓氧治療設(shè)備:單人醫(yī)用高壓純

6、氧艙，氧氣由海軍總醫(yī)院中心氣站提供。
　　1.3 十字高架迷宮材料:自制十字高架迷宮:高35cm，2個(gè)開臂及2個(gè)閉合臂寬10cm長50cm，閉合臂壁高25cm，內(nèi)側(cè)及底部涂黑。十字高架迷宮上方1米處設(shè)有照明用500W燈及攝像頭。
　　1.4 曠場試驗(yàn)材料:曠場環(huán)境長100cm，寬100cm，高35cm，四周及底部涂黑，底部用白線分成20cm×20cm小格，共25個(gè)。曠場上方1m處設(shè)有照明用500W光源及攝像頭。
　　1

7、.5 免疫組織熒光材料:異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，大鼠GR的單克隆抗體一抗。
　　1.6 心率變異度測量及計(jì)算:多導(dǎo)生理測量儀
　　1.7 血清學(xué)檢測:促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（corticotropin releasinghormone，CRH）、促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocor ticotropic hormore，ATCH）、糖皮質(zhì)激素（

8、glucocorticoids，GCS）、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)、一氧化氮(nitric oxide，NO)及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)，使用MULTISKAN EX酶標(biāo)儀檢測。
　　2.分組及實(shí)驗(yàn)方法
　　2.1 高壓氧對大鼠十字高架試驗(yàn)的影響
　　將20只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分成2組:單純高壓氧組和空白對照組

9、，每組10只。單純高壓氧組給予2.0ATA高壓氧治療1次/d;空白對照組單純飼養(yǎng)，共21d。
　　2.2 慢性束縛及高壓氧處理對大鼠心率變異度及曠場試驗(yàn)的影響
　　將40只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分成4組:單純束縛組、單純高壓氧組、高壓氧聯(lián)合束縛組和空白對照組，每組10只。單純束縛組給予行為限制3h/d;單純高壓氧組給予2.0ATA高壓氧治療1次/d;高壓氧聯(lián)合束縛組，每天先后給予高壓氧處理與束縛處理;空白對照組單純飼養(yǎng)，共

10、21d。
　　“慢性束縛及高壓氧處理對大鼠海馬區(qū)GR表達(dá)及血清HPA軸激素水平的影響”與“慢性束縛及高壓氧處理對大鼠一氧化氮系統(tǒng)及促炎癥因子表達(dá)的影響”分組方式同2.2。
　　3.觀察指標(biāo)
　　3.1 高壓氧對大鼠十字高架試驗(yàn)的影響
　　以適應(yīng)環(huán)境一周后的第1、7、14、21天對其進(jìn)行十字高架迷宮(elevated plusmaze)試驗(yàn)，觀察其開臂(Open Arm，OA)逗留時(shí)間，統(tǒng)計(jì)采用兩因素重復(fù)測量的方差

11、分析。
　　3.2 慢性束縛及高壓氧處理對大鼠心率變異度及曠場試驗(yàn)的影響
　　以適應(yīng)環(huán)境一周后觀察大鼠在第1d、第11d、第21d曠場試驗(yàn)中運(yùn)動能力（水平得分）及探索行為（垂直得分）的變化，心電的檢測第21天大鼠自主神經(jīng)的變化。
　　3.3 慢性束縛及高壓氧處理對大鼠海馬區(qū)GR表達(dá)及血清HPA軸激素水平的影響。
　　21天處理后，利用免疫熒光染色檢測大鼠海馬區(qū)GR的表達(dá)水平。利用酶聯(lián)免疫吸附測定法測定其血清中CR

12、H、ACTH和GCS的含量。
　　3.4 慢性束縛及高壓氧處理對大鼠一氧化氮系統(tǒng)及促炎癥因子表達(dá)的影響
　　利用酶聯(lián)免疫吸附測定法測定血清中NOS、NO及TNF-α的含量。
　　4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　利用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，計(jì)數(shù)資料以秩來表示，連續(xù)時(shí)間點(diǎn)上行為學(xué)的差異比較采用重復(fù)測量的方差分析。組間差異以及高壓氧和束縛兩因素相互關(guān)系的分析采用兩因素析因分析設(shè)

13、計(jì)資料的方差分析。組間兩兩比較采用LSD-t法。計(jì)數(shù)資料采用秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.十字高架迷宮顯示:分組因素不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.450)，高壓氧處理與空白對照組在焦慮程度上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.曠場試驗(yàn)顯示:與空白對照組比較，單純束縛組在第11d水平得分（115.5±43.4）和垂直得分（23.9±10.1）均明顯升高(P＜0.001);與單純束縛組比較，高壓氧

14、聯(lián)合束縛組在第1d到第11d的得分升幅減小(P＜0.01)。
　　3.心率變異度顯示:4組間LF/HF、交感及副交感活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但仍能看出以下趨勢:束縛及高壓氧治療均可導(dǎo)致交感神經(jīng)張力下降，而高壓氧治療可引起副交感神經(jīng)張力上升。
　　4.免疫組織熒光染色顯示:單純束縛組海馬區(qū)GR表達(dá)(0.1546±0.0154)比空白對照組(0.2174±0.0123)減少(P＜0.001)，高壓氧聯(lián)合束縛組與空白對照組比較無明顯

15、差異(P＞0.05)。
　　5.HPA軸激素顯示:4組血清CRH、ATCH及GCS差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但可以得出以下趨勢:單純高壓氧組，單純束縛組，高壓氧聯(lián)合束縛組ACTH及GCS均較空白對照組有所升高，高壓氧聯(lián)合束縛組CRH水平較另三組下降。
　　6.4組大鼠血清總NO、NOS及TNF-α差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但仍能得出以下趨勢:單純束縛組NOS水平較各組下降，束縛聯(lián)合高壓氧處理后發(fā)現(xiàn)血清TNF-α較單純束縛組下降。
　　

16、結(jié)論：
　　1.高壓氧處理后a.大鼠焦慮程度無明顯變化;b.大鼠出現(xiàn)輕度的交感神經(jīng)張力下降及副交感興奮;c.海馬區(qū)GR表達(dá)無明顯變化;d.大鼠血清HPA軸激素水平有所升高，而NO、NOS及TNF-α無明顯變化。提示高壓氧處理具有一般應(yīng)激的特征，但應(yīng)激強(qiáng)度不大。
　　2.束縛處理后a.大鼠行為學(xué)試驗(yàn)表現(xiàn)出明顯的焦慮狀態(tài);b.大鼠出現(xiàn)交感神經(jīng)張力下降;c.海馬區(qū)GR表達(dá)下降;d.大鼠血清GCS水平升高，但CRH及ACTH無明顯變

17、化;e.大鼠NOS水平下降。提示慢性束縛在一定范圍內(nèi)模擬慢性應(yīng)激的生理狀態(tài)。
　　3.高壓氧聯(lián)合束縛處理后a.大鼠的焦慮狀態(tài)較單純束縛有所減輕;b.大鼠出現(xiàn)交感神經(jīng)張力下降，但下降程度要小于單純束縛組;c.海馬區(qū)GR表達(dá)未見明顯下降;d.大鼠血清ACTH及GCS均較空白對照組有所升高，但高壓氧聯(lián)合束縛組CRH水平較另三組有所下降。e.束縛聯(lián)合高壓氧處理后發(fā)現(xiàn)血清TNF-α較單純束縛組下降。提示高壓氧能減緩束縛對大鼠相關(guān)生理指標(biāo)的影