四元鎂鈣鍶鋅合金生物學(xué)性能及抗菌性能的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、骨科術(shù)后植入物部位感染是最常見的并發(fā)癥之一，文獻(xiàn)報(bào)道，骨折內(nèi)固定與人假體置換后的感染率分別為5％-20％和0.5％-2％[1]，植入物感染不僅導(dǎo)致患者術(shù)后功能恢復(fù)較差，而且延長了患者的住院時(shí)間，增加了住院花費(fèi)及再入院率。雖然目前無菌操作及抗生素的應(yīng)用及不斷發(fā)展，植入物周圍感染仍然面臨著嚴(yán)峻的考驗(yàn)。目前研究[2]表明:內(nèi)固定物周圍一旦感染，細(xì)菌粘附在材料表面或骨與材料界面定植會(huì)引發(fā)感染的持續(xù)存在，一旦細(xì)菌定植之后，會(huì)在材料表面形成一層生物

2、膜，這層生物膜可以防止細(xì)菌免于人類防御系統(tǒng)的攻擊，因此，傳統(tǒng)的全身抗生素應(yīng)用很難治愈這種植入物周圍的感染，唯一有效的治療方法是取出植入物徹底清創(chuàng)，最終導(dǎo)致內(nèi)固定穩(wěn)定喪失給患者造成更大的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。因此，研究和開發(fā)一種新型抗菌骨科植入材料已經(jīng)成為當(dāng)務(wù)之急。
　　鎂作為一種新型的生物可降解金屬材料，具有較高的比強(qiáng)度和比剛度，適宜的密度及力學(xué)性能，并且比傳統(tǒng)植入材料更加接近骨骼的彈性模量，能避免二次手術(shù)及有效緩解應(yīng)力遮擋效應(yīng)等

3、優(yōu)點(diǎn)[4]，具有廣泛的醫(yī)用價(jià)值。但由于鎂在機(jī)體內(nèi)降解速率過快，難以維持穩(wěn)固效果，并在腐蝕過程中產(chǎn)生大量的氫氣，導(dǎo)致其臨床應(yīng)用受限[5]。合金化可顯著提高鎂合金的耐蝕性能，是目前醫(yī)用鎂合金應(yīng)用研究的重點(diǎn)[6]，但一些元素對人體是有害的[7]，如鋁對神經(jīng)元有害，與癡呆、阿爾茲海默病有關(guān);鐠、鈰、釔等稀土元素有肝毒性，鋯和鈰有細(xì)胞毒性，鋰有潛在的致畸作用。
　　基于北京大學(xué)工學(xué)院鄭玉峰教授前期大量的體內(nèi)、體外研究數(shù)據(jù)表明，鎂鈣合金(Mg

4、-1.0wt％Ca alloy)具有良好的生物相容性和良好的抗腐蝕性能，是較為理想的鎂合金材料，但其動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，由于其降解速率仍然較快，無法維持足夠時(shí)長的機(jī)械強(qiáng)度。鍶元素是人體必需的、無毒性的微量元素之一，可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化和抑制破骨細(xì)胞活性，并且可以明顯改善鎂的晶粒大小從而提高其耐腐蝕性能[8，9]。此外，有關(guān)文獻(xiàn)[9]表明:適量比例的Ca和Sr元素加入純鎂中可以很好的改善鎂晶粒大小從而提高整體的機(jī)械性能， Berglund等

5、[10]證實(shí):三元鎂合金中，Mg-1.0Ca-0.5Sr顯示出最佳的抗腐蝕性能，與Mg-1.0Ca相比，有著更加優(yōu)越的耐腐蝕性及機(jī)械性能，而且具有良好的生物相容性。
　　目前鎂合金研究大都集中材料性能及生物成骨性上。然而，面對臨床上骨科內(nèi)固定植入物感染日趨嚴(yán)峻的形勢，研究和開發(fā)具有抗菌性能的可降解鎂合金植入材料具有很實(shí)際的意義。鋅是人體必需微量元素之一，在機(jī)體內(nèi)幾乎參與所有生理代謝過程，鋅除了在多種金屬酶、轉(zhuǎn)錄因子及其他蛋白中起著

6、催化或構(gòu)建作用外，還以神經(jīng)遞質(zhì)或調(diào)質(zhì)樣的形式發(fā)揮其功能[11，12]。與此同時(shí)，有關(guān)研究[12，13]表明鋅具有良好的抗菌性能，而且同時(shí)能夠促進(jìn)成骨和提高合金耐腐蝕性能和機(jī)械強(qiáng)度。
　　因而，我們提出將微量的鋅元素添加到三元Mg-1Ca-0.5Sr合金材料中，設(shè)計(jì)出四種新型的Mg-1Ca-0.5Sr-xwt.％Zn(x=0，2，4，6)四元合金材料，希望既能提高合金的耐腐蝕性能，又能發(fā)揮良好的抗菌性能。
　　目的：
　

7、　體外條件下觀察四種新型鎂合金材料對細(xì)胞生長、增殖及活力的影響，初步評(píng)價(jià)材料生物學(xué)性能，驗(yàn)證其作為一種新型醫(yī)用可降解金屬材料的安全性及有效性，隨后通過直接和間接抗菌法探討四種鎂合金體外抗菌性能，為后期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用提供依據(jù)。
　　方法：
　　1.材料的表征:通過電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(ICP-AES)分析不同鎂合金材料的化學(xué)組成，并測定浸提液中離子溶度;通過掃描電鏡觀察材料的表面形貌;能譜分析儀及X線衍射儀檢測材

8、料晶界的組成及化學(xué)成分;通過pHmeter(Sartorius，PB-10)和Micro-Sample Osmometer(Fiske210)分別測定Hank's液和PBS緩沖液材料浸提液的pH值及滲透壓;通過自制設(shè)備測定Hank's液中四種鎂合金材料氫氣釋放率，綜合評(píng)價(jià)和比較四種鎂合金材料耐腐蝕性能及機(jī)械性能。
　　2.生物相容性試驗(yàn):按照IS010993-12標(biāo)準(zhǔn)(試樣表面積/浸體介質(zhì)=1.25cm2/ml)分別制備四種鎂合金

9、浸提液，空白對照組(Ti-6Al-4V)采用含10％FBS的α-MEM培養(yǎng)基浸提，進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞。倒置顯微鏡觀察各種浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài);采用LDH實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)四種鎂合金材料對細(xì)胞的毒性;MTT法檢測四種材料對細(xì)胞相對增殖率的影響;鈣黃綠素染色評(píng)價(jià)不同材料浸提液對活/死細(xì)胞比例的影響，根據(jù)上述結(jié)果綜合評(píng)價(jià)四種鎂合金材料的生物細(xì)胞安全性，并進(jìn)行對比分析。
　　3.抗菌性能:采用間接接觸抗菌法法評(píng)價(jià)四種鎂合金材料浸提液對金黃色葡萄球菌的抗菌

10、性能，并根據(jù)不同時(shí)段浸提液對細(xì)菌活性的影響繪制抗菌曲線;直接接觸抗菌法直接評(píng)價(jià)材料對金黃色葡萄球菌的抗菌性能;細(xì)菌鈣黃綠素/PI染色法觀察不同鎂合金材料表面活/死細(xì)菌數(shù)目;DAPI染色法及電鏡評(píng)價(jià)不同材料表面細(xì)菌粘附性能及數(shù)目、形態(tài)的差異，綜合評(píng)估和對比四種鎂合金材料對金黃色葡萄球菌的抗菌性能。
　　結(jié)果：
　　1.1.材料的表征
　　1.1.1 通過ICP-AES分析得出四種材料的成分和元素含量基本為Mg-1.0wt

11、％-0.5Sr-x wt.％Zn(x=0，2，4，6)四種合金材料，與我們理想設(shè)計(jì)時(shí)的基本一致;相對于Mg-1Ca-0.5Sr浸提液中，含Zn鎂合金組浸提液中鎂離子較高并且隨著Zn離子溶度呈正相關(guān);各組材料浸提液中鈣離子溶度基本相同;Mg-1Ca-0.5Sr-4Zn中鍶離子溶度最高，其他幾組浸提液中鍶離子溶度基本相同;鋅離子溶度與材料中鋅含量呈梯度增加。
　　1.1.2 電子掃描電鏡顯示隨著鎂合金中鋅元素含量的不斷增加，合金的晶粒

12、不斷細(xì)化，合金的晶界不斷從斷續(xù)狀向連續(xù)的網(wǎng)狀變化，且合金的晶界同時(shí)會(huì)發(fā)生粗化形成片狀化現(xiàn)象。能譜分析儀可見鎂鈣鍶鋅合金的晶界內(nèi)由大量的Ca和Zn組成，說明鈣鋅主要以以第二相的形式存在于晶界內(nèi)。
　　1.1.3 XRD分析儀得出四種鎂合金主要由Mg2Ca，CaZn3，Ca2Mg5Zn13，Ca2Mg6 Zn3，Ca2Mg6Zn3，Mg17Sr2。隨著Zn含量的增加，第二相中Ca2Mg6Zn3的含量也隨之增多。
　　1.1.4

13、pH分析儀及Micro-Sample Osmometer(Fiske210)檢測其浸提液的pH值和滲透壓結(jié)果:Hank's液中，隨著浸泡時(shí)間的延長，四組鎂鈣鍶鋅合金浸提液pH值隨著浸提時(shí)間的增加逐漸升高，含鋅的三種鎂合金浸提液pH最后趨于平衡（pH值均在8.75-10.75），而在整個(gè)浸泡實(shí)驗(yàn)中Mg-1Ca-0.5Sr合金材料浸提液組pH始終呈上升趨勢，未見明顯平穩(wěn)趨勢。四種材料PBS浸提液，稀釋后用于抗菌實(shí)驗(yàn)的共培養(yǎng)液，除了Mg-1C

14、a-0.5Sr組pH有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外，其他組pH和滲透壓沒有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但各組數(shù)值均在維持細(xì)菌活性的理想范圍內(nèi)。
　　1.1.5浸泡實(shí)驗(yàn)和釋氫實(shí)驗(yàn)表明:添加鋅后的鎂合金材料的耐腐蝕性能和機(jī)械性能都有所提高。
　　1.2 材料的生物相容性
　　1.2.1 LDH細(xì)胞活力檢測結(jié)果顯示:與對照組相比，不同含鋅量的鎂合金材料組浸提液與MC3T3-E1細(xì)胞共培養(yǎng)24h后，細(xì)胞活力未見明顯差異。
　　1.2.2 MTT結(jié)

15、果顯示，與對照組相比，四種鎂合金材料浸提液組與MC3T3-E1細(xì)胞共同培養(yǎng)2、4天后，各組之間未見明顯差異，符合0級(jí)標(biāo)準(zhǔn);培養(yǎng)6天后，四種鎂合金材料組細(xì)胞增值率有所下降，Mg-1Ca-0.5Sr-6Zn、Mg-1Ca-0.5Sr與對照組間顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但各組毒性都處于0-1級(jí)之間。
　　1.2.3 鈣黃率素染色后倒置熒光顯微鏡下觀察四種材料浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞，貼壁良好，呈正常生長，細(xì)胞形態(tài)呈梭形，未見明顯細(xì)胞溶解及紅染死細(xì)胞等。

16、
　　1.3 材料抗菌性能
　　1.3.1 不同時(shí)間點(diǎn)材料浸提液與細(xì)菌共培養(yǎng)24小時(shí)后涂板結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著浸提時(shí)間的增加，含Zn鎂合金材料的抗菌性能逐漸增強(qiáng)。72小時(shí)后共培養(yǎng)液中，含Zn的鎂合金材料的抗菌率基本接近100％，其中抗菌性能的強(qiáng)弱與鎂合金中Zn含量呈正相關(guān)。不含Zn鎂合金材料組也顯示出微弱的抗菌性能，但是整個(gè)過程中抗菌性能未見明顯變化。
　　1.3.2 材料與細(xì)菌共培養(yǎng)6小時(shí)后24小時(shí)涂板結(jié)果顯示:四種鎂合金

17、材料表面對細(xì)菌皆有很強(qiáng)的抗菌性能;鈣黃綠素染色結(jié)果顯示:共培養(yǎng)液中鎂合金材料表面的細(xì)菌幾乎死亡;DAPI實(shí)驗(yàn)表明:材料表面對細(xì)菌的抗粘附性與時(shí)間和Zn含量呈正相關(guān);電鏡結(jié)果表明:與材料共培養(yǎng)后細(xì)菌形態(tài)幾乎沒有改變，但數(shù)目相對于對照組明顯下降。
　　結(jié)論：
　　1.四種鎂合金材料均由Mg2Ca，CaZn3，Ca2Mg5Zn13，Ca2Mg6Zn3，Ca2Mg6Zn3，Mg17Sr這些化合物組成，但隨著材料中Zn含量的增加，其C

18、a2Mg6Zn3的含量逐漸增加，材料表面的晶粒大小明顯細(xì)化;
　　2.與三元Mg-1Ca-0.5Sr相比，含Zn鎂合金材料組抗腐蝕性能得到明顯提高;
　　3.四種鎂合金材料皆可通過細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)，具有良好的生物相容性;
　　4.四種鎂合金材料皆具有明顯的抗菌性能，其中含鋅鎂合金顯示出更強(qiáng)的抗菌性能并且與鋅含量呈正相關(guān)。
　　5.該系類新型鎂鈣鍶鋅合金體內(nèi)試驗(yàn)本課題尚未涉及，因而其能否成為一種新型可降解抗菌內(nèi)植入材料