前胡質(zhì)量評價方法及呋喃香豆素類同分異構體質(zhì)譜分析方法研究.pdf

1、前胡為傘形科植物白花前胡Peucedanum praeruptorum Dunn的干燥根?！吨袊幍洹酚涊d前胡有降氣化痰、散風清熱的功效，用于痰熱喘滿，咳痰黃稠，風熱咳嗽痰多等癥。香豆素類化合物是前胡中的主要化學成分，包括角型吡喃香豆素、呋喃香豆素和其他香豆素，是前胡質(zhì)量評價的重要指標。目前對前胡的質(zhì)量研究集中在化學成分的定性分析，或?qū)ι贁?shù)香豆素成分進行定量分析，尚缺乏對前胡藥材中香豆素類化合物進行全面鑒定和定量分析的方法。本研究針對前

2、胡質(zhì)量評價中存在的問題進行了以下兩方面研究：1采用超高效液相色譜串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜技術（UHPLC-Q-TOF-MS/MS），建立了前胡中香豆素類成分同時鑒定和定量的分析方法，并對不同前胡樣品和混淆品進行比較。2依據(jù)《歐洲藥典》起草了前胡的質(zhì)量標準。包括性狀，粉末顯微鑒別，薄層色譜法鑒別，水分、總灰分和酸不溶性灰分的檢查，白花前胡甲素和白花前胡乙素的高效液相色譜法含量測定。
　　呋喃香豆素類化合物廣泛分布于高等植物中，其基本骨架由苯

3、并?吡喃酮和呋喃環(huán)構成，分為線型和角型兩種，并常以C-5位和C-8位不同取代的同分異構體形式共存。由于同分異構體具有分子量相同、結構相近和理化性質(zhì)相似等特點，通常具有相似的色譜行為和質(zhì)譜裂解特征而不易區(qū)分。本文采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術，通過研究4對呋喃香豆素同分異構體，總結了特征碎片離子的相對豐度比法（RRA）用以區(qū)分C-5位和C-8位不同取代的同分異構體，并將此方法用于白芷中呋喃香豆素同分異構體的區(qū)分，為中藥復雜體系

4、中異構體的研究提供了新思路。
　　第一部分前胡中香豆素類化合物同時鑒定和定量分析方法的建立及其在前胡與混淆品分析中的應用
　　目的：采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術，建立同時鑒定和定量分析前胡中香豆素類成分的方法，并評價不同前胡樣品和混淆品的質(zhì)量。
　　方法：
　　1.檢測條件：采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術對樣品進行檢測。色譜柱為Thermo Hypersil GOLD（100 mm×2.

5、1 mm，3μm），流動相為1 mmol/L乙酸銨水溶液（A）和乙腈（B），梯度洗脫，流速為0.5 mL/min；進樣量5μL。高分辨質(zhì)譜采用ESI源，正離子模式，一級全掃描采集，采用動態(tài)背景扣除和信息依賴采集觸發(fā)二級碎片的采集，每一循環(huán)采集12個最強峰的二級質(zhì)譜圖。
　　2.樣品制備：甲醇作為提取溶劑，采用超聲處理的方式制備樣品。
　　3.化合物鑒定和定量分析：將已知的化學式輸入數(shù)據(jù)處理軟件MasterView中，對誤差范

6、圍在±5 ppm內(nèi)的色譜峰基于精確分子質(zhì)量和一級、二級質(zhì)譜圖，結合香豆素的裂解規(guī)律和文獻中已報道的化合物的裂解途徑進行鑒定；在進行鑒定的同一分析周期內(nèi)，對有對照品的9個成分白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡素E、歐前胡素、異歐前胡素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、補骨脂素和異茴芹內(nèi)酯進行絕對定量，對所有色譜峰得到專屬分離的化合物采用峰面積進行相對量測定。
　　4.樣品分析：以對照藥材中各定量化合物的峰面積為標準，其他樣品中各化合物峰面積

7、與之比較，產(chǎn)生峰面積比值，基于峰面積比值的和及主成分分析法對23批前胡樣品進行分析。依據(jù)已鑒定的化合物對13批前胡混淆品進行分析。
　　結果：應用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術分析鑒定了前胡中54個香豆素類化合物，包括36個角型吡喃香豆素、13個呋喃香豆素和5個其他香豆素。其中色譜峰得到專屬分離的化合物共29個。9種成分在測定濃度范圍內(nèi)線性關系良好，儀器重復性、檢測限、定量限、精密度、準確度和穩(wěn)定性均符合要求。9種化學成分

8、在所有批次樣品中的總含量范圍為694.57~26532.10μg/g，RSD值為51％。29個化合物中有8個角型吡喃香豆素和2個呋喃香豆素的峰面積在樣品中較大。PCA分析結果表明前胡香豆素E、白花前胡甲素和3'-（異戊酰氧基/2-甲基丁酰氧基）-4'-（異戊酰氧基/2-甲基丁酰氧基）凱爾消旋內(nèi)酯的含量是評價前胡藥材質(zhì)量的關鍵因素。對13批前胡混淆品的分析結果表明紫花前胡、少毛北前胡、毛前胡和石防風具有與白花前胡一定相同的物質(zhì)基礎，且可以

9、分別利用15、13、14和31個香豆素成分區(qū)分白花前胡與紫花前胡、少毛北前胡、毛前胡和石防風。前胡混淆品隔山香不具有與白花前胡相似的物質(zhì)基礎。前胡已鑒定的54個化合物中有8個化合物（6個角型吡喃香豆素、1個呋喃香豆素和1個其他香豆素）均不存在于13批混淆品中。
　　結論：本研究首次建立了同一分析周期內(nèi)同時鑒定和定量分析前胡中香豆素成分的UHPLC-Q-TOF-MS/MS法。該法簡便、靈敏度高、專屬性強。對前胡樣品和前胡混淆品的分析

10、可知角型吡喃香豆素是評價前胡質(zhì)量的關鍵，且能用于區(qū)分前胡及其混淆品。
　　第二部分前胡質(zhì)量標準研究
　　目的：建立前胡質(zhì)量評價方法，為《歐洲藥典》前胡質(zhì)量標準的制訂提供參考。
　　方法：以9批樣品為分析對象，探索前胡質(zhì)量評價方法。
　　1.鑒別：采用性狀鑒別、顯微鑒別和薄層色譜鑒別法。觀察前胡的外觀性狀及其粉末在顯微鏡下的特征；薄層色譜鑒別法以甲醇作為提取溶劑，超聲處理的方法制備樣品，使用硅膠G薄層板，以環(huán)己烷-

11、乙酸乙酯（2:1）為展開劑，紫外光燈（365 nm）下檢視。
　　2.檢查：依據(jù)《歐洲藥典》中的檢查方法對前胡進行水分、總灰分和酸不溶性灰分的檢查。
　　3.含量測定：采用高效液相色譜法測定白花前胡甲素和白花前胡乙素兩成分。以甲醇作為提取溶劑，超聲處理時間為30分鐘，提取液直接測定分析。采用Thermo ODS HYPERSIL色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm），以甲醇-水（68:32）為流動相，流速0.8 mL/

12、min，進樣體積10μL，檢測波長322 nm。
　　結果：
　　1.鑒別：前胡外觀性狀突出，具有特征性的縱溝、縱皺紋及橫向皮孔樣突起；前胡粉末顯微特征突出，具有特征性的木栓細胞、導管和木纖維；薄層色譜法可見7個熒光斑點。
　　2.檢查：9批樣品的含水量均小于8.9%，總灰分均小于7.8%，酸不溶性灰分均小于3.4%。
　　3.含量測定：白花前胡甲素和白花前胡乙素分別在5.00~400.00μg/mL和0.50~

13、40.00μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好，回歸方程分別為 Y=28.4782224X+6.484094（r=0.99999）和Y=25.5893187X-0.3288223（r=0.99999），精密度（RSD）均在0.6%~2.0%之間，加樣回收率均在90.7%~104.8%之間。白花前胡甲素的含量范圍為0.73%~2.24%，白花前胡乙素的含量范圍為0.12%~0.33%。
　　結論：本文建立的鑒別、檢查和含量測定方法穩(wěn)定，更簡

14、便，可用于前胡的質(zhì)量控制。
　　第三部分 UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術區(qū)分呋喃香豆素類同分異構體及其在白芷中的應用
　　目的：建立一種快速、穩(wěn)定的區(qū)分C-5位和C-8位不同取代的呋喃香豆素類同分異構體的質(zhì)譜方法，并將其應用于白芷中呋喃香豆素類同分異構體的鑒定。
　　方法：采用 UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術中的 MS-IDA-12MS/MS模式和子離子掃描模式對4對同分異構體，花椒毒素和佛手柑內(nèi)酯、歐

15、前胡素和異歐前胡素、補骨脂素和異補骨脂素、茴芹內(nèi)酯和異茴芹內(nèi)酯進行采集，使用 MasterView軟件對其碎裂規(guī)律和碎片信息進行總結和分析，建立呋喃香豆素類同分異構體的質(zhì)譜區(qū)分方法，并對白芷中的呋喃香豆素類同分異構體進行鑒定區(qū)分。采用Epic C18色譜柱（15 cm×2.1 mm，3μm），流動相為1 mmol/L乙酸銨水溶液（A）和甲醇（B），梯度洗脫。
　　結果：建立特征碎片離子的相對豐度比法（RRA）用于C-5位和C-8位