粘細(xì)菌chaperone-usher通路調(diào)節(jié)因子的篩選及鑒定.pdf

1、目的:
　　分子伴侶/引領(lǐng)蛋白(chaperone/usher，CU)通路是目前為止最普遍最具有代表性的菌毛裝配途徑，可以分為經(jīng)典型、交替型和遠(yuǎn)古型三大家族，其中遠(yuǎn)古型CU通路分布最廣，存在于許多重要的致病微生物和環(huán)境微生物中。黃色粘球菌（Myxococcus xanthus）是一種土壤中的革蘭氏陰性細(xì)菌，因其復(fù)雜的多細(xì)胞發(fā)育行為而成為研究原核生物發(fā)育的良好模型。前期工作中我們發(fā)現(xiàn)，黃色粘球菌遠(yuǎn)古型CU基因簇mcuABCD（MXA

2、N3885-3882，其中mcuABC組成操縱子）參與孢子外殼蛋白的分泌，提示CU依賴性孢子外殼與菌毛的組裝在進(jìn)化上存在相關(guān)性。c-di-GMP[cyclic bis（3'-5'）diguanylicacid]是細(xì)菌體內(nèi)重要的的第二信使分子，參與調(diào)節(jié)細(xì)菌的多種生理功能。本論文擬從環(huán)二鳥苷酸代謝酶候選基因入手，發(fā)現(xiàn)、鑒定粘細(xì)菌CU系統(tǒng)(Mcu)的調(diào)節(jié)因子，以完善遠(yuǎn)古型CU通路的調(diào)控機(jī)制，為阻斷細(xì)胞表面粘附性致病因子的合成提供新思路。

3、>　　方法:
　　1.RT-PCR檢測c-di-GMP代謝酶候選基因在粘細(xì)菌發(fā)育階段的表達(dá)情況;
　　2.選擇發(fā)育階段表達(dá)的兩個c-di-GMP代謝酶候選基因MXAN2424和MXAN5199，進(jìn)一步通過報告基因分析它們的表達(dá)譜;
　　3.通過同源重組構(gòu)建MXAN2424和MXAN5199各自的敲除菌株;
　　4.通過報告基因、Western blot等方法檢測野生菌株和敲除菌株中mcuABC的表達(dá)，分析MXAN

4、2424和MXAN5199是否為mcuABC的表達(dá)所必需;觀察敲除菌株發(fā)育表型;
　　5.高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）定量分析野生菌株和敲除菌株中c-di-GMP含量，結(jié)合定點(diǎn)突變、基因互補(bǔ)和純化蛋白的酶學(xué)特性分析，初步判斷MXAN2424和MXAN5199是否為c-di-GMP降解酶或合成酶。
　　結(jié)果:
　　1.RT-PCR顯示，發(fā)育階段表達(dá)

5、的c-di-GMP代謝酶候選基因有MXAN2424、MXAN2807、MXAN3705、MXAN4232、MXAN4675、MXAN5199、MXAN5340;
　　2.報告基因進(jìn)一步證實(shí)MXAN2424和MXAN5199在非發(fā)育及發(fā)育階段均有表達(dá);
　　3.成功構(gòu)建了兩個基因敲除菌株△MXAN2424和△MXAN5199，兩個敲除菌中mcuA的表達(dá)均延遲;從發(fā)育表型看，△MXAN2424細(xì)胞聚集無異常，而△MXAN5199

6、細(xì)胞聚集晚于野生型大約18h，且△MXAN5199細(xì)胞聚集時序與該菌株中mcuA的表達(dá)時序接近;
　　4.在發(fā)育18h和24 h時，△MXAN2424中c-di-GMP含量高于野生型，△MXAN5199中c-di-GMP含量低于野生型，提示MXAN2424和MXAN5199分別為c-di-GMP降解酶和合成酶;
　　5.大腸桿菌表達(dá)純化的MXAN2424蛋白可以水解磷酸二酯酶（phosphodiesterase，PDE）底物

7、對硝基苯基磷酸酯[bis（p-nitrophenyl）phosphate，bis-ρNPP]，大腸桿菌磷酸二酯酶基因yahA能部分挽救△MXAⅣ2424中mcuA的表達(dá)延遲，進(jìn)一步提示MXAN2424具有c-di-GMP降解酶PDE活性，調(diào)節(jié)c-di-GMP水平并影響Mcu的表達(dá);但MXAN2424中預(yù)測的與PDE活性相關(guān)的保守氨基酸(E59)突變后并不影響mcuA表達(dá)的時序和水平，推測僅突變一個氨基酸影響較小，或此酶蛋白活性中心不含谷

8、氨酸;
　　6.MXAN5199中預(yù)測的與c-di-GMP合成酶活性相關(guān)的保守氨基酸(E221)突變后并不影響mcuA表達(dá)的時序和水平，推測僅突變一個氨基酸影響較小，或此酶蛋白活性中心不含谷氨酸，或MXAN5199雖然為c-di-GMP合成酶，但其對mcuA的表達(dá)調(diào)節(jié)并不是通過影響c-di-GMP的水平實(shí)現(xiàn)的，即除作為c-di-GMP合成酶外，MXAN5199可能還具有其它功能。此外，MXAN5199蛋白FHA結(jié)構(gòu)域保守氨基酸R5

9、5突變后延緩mcuA的表達(dá)，提示該結(jié)構(gòu)域?yàn)閙cuA及時表達(dá)所必需。
　　結(jié)論:
　　1.在粘細(xì)菌發(fā)育階段有多個c-di-GMP代謝候選基因的表達(dá);
　　2.XAN2424與MXAN5199均為Mcu及時表達(dá)所必需;此外，MXAN519還為粘細(xì)菌正常發(fā)育所必需;
　　3.MXAN2424具有磷酸二酯酶活性，通過影響c-di-GMP水平對粘細(xì)菌CU通路進(jìn)行部分調(diào)節(jié);
　　4.MXAN5199可能具有c-di-G