拘束應(yīng)激增加小鼠流感病毒易感性機(jī)制研究及小分子活性肽Carnosine的干預(yù)作用.pdf

1、除了病毒本身的因素外，宿主自身的易感性在流感疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)病原體感染機(jī)體時(shí)，機(jī)體主要通過直接抗病毒作用與增強(qiáng)機(jī)體對(duì)病原體的耐受能力發(fā)揮自我保護(hù)作用。當(dāng)機(jī)體無(wú)法有效發(fā)揮這兩種作用，會(huì)引起嚴(yán)重感染導(dǎo)致死亡，被稱為流感的“易感個(gè)體”。研究表明新生兒、老年人、患有基礎(chǔ)代謝疾病及疲倦或應(yīng)激負(fù)荷下的人群屬于感染流感病毒的“易感人群”，且這部分人群感染流感后死亡率顯著升高，但關(guān)于這些因素是如何增加機(jī)體“易感性”的機(jī)理尚不

2、明確。因此，深入研究流感“易感性”形成機(jī)制及如何降低機(jī)體“易感性”在防治流感病毒感染中具有重要意義。應(yīng)激負(fù)荷能激活下丘腦-垂體-腎上腺（Hypothalamic pituitaryadrenal。HPA）軸增加糖皮質(zhì)激素皮質(zhì)酮（Cortisostone。CORT）的分泌，同時(shí)CORT能夠調(diào)控先天性免疫反應(yīng)保護(hù)機(jī)體抵御病原體感染。前期研究發(fā)現(xiàn)拘束應(yīng)激負(fù)荷能增加小鼠對(duì)流感病毒的易感性。因此，本課題以拘束應(yīng)激負(fù)荷與CORT負(fù)荷建立小鼠與細(xì)胞“

3、易感性”模型，探索CORT在拘束應(yīng)激負(fù)荷增強(qiáng)機(jī)體流感“易感性”的作用及機(jī)制。
　　首先，本論文研究了拘束應(yīng)激負(fù)荷誘導(dǎo)的應(yīng)激激素CORT對(duì)小鼠流感病毒“易感性”的影響。將小鼠放置于50mL通風(fēng)良好的離心管中拘束負(fù)荷18 h，小鼠于給藥前1 d開始拘束負(fù)荷，拘束應(yīng)激負(fù)荷18 h后第3 d以2×LD50的H1N1病毒經(jīng)滴鼻感染小鼠，實(shí)驗(yàn)組小鼠于拘束負(fù)荷后開始每天皮下注射1 mg/kgCORT或25 mg/kg米非司酮（Mifeprist

4、one,RU486），連續(xù)給藥3 d，正常對(duì)照組、病毒組和拘束病毒模型組小鼠給予等量溶劑聚乙二醇（Polyethylene glycol,PEG）。感染流感病毒后連續(xù)觀察21d或者4d，檢測(cè)小鼠感染流感病毒后的發(fā)病率、死亡率與肺組織中的病毒量（Nuclear protein。NP）變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，拘束應(yīng)激負(fù)荷小鼠與CORT負(fù)荷小鼠感染流感病毒后發(fā)病率、死亡率明顯升高，肺組織中的病毒復(fù)制水平（NP蛋白表達(dá)）明顯增加，且肺部病理?yè)p傷顯著

5、加劇，而皮質(zhì)酮受體抑制劑RU486能夠改善上述過程。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，應(yīng)激激素CORT增強(qiáng)了小鼠對(duì)流感病毒“易感性”。
　　其次，研究應(yīng)激激素CORT對(duì)線粒體抗病毒信號(hào)蛋白（Mitochondrial antiviral signaling protein。MAVS）通路的影響。病毒感染機(jī)體時(shí)，體內(nèi)的MAVS被激活形成多聚體。MAVS聚集體激活 IRF3與 NF-κB誘導(dǎo)產(chǎn)生大量 I型干擾素（Interferon-I。IFN-I）

6、與抗病毒蛋白（antiviral protein。AVP）從而抑制病毒的感染。本實(shí)驗(yàn)探討了拘束應(yīng)激負(fù)荷增加小鼠流感病毒“易感性”是否與應(yīng)激誘導(dǎo)的CORT調(diào)控MAVS抗病毒信號(hào)通路活性有關(guān)。將昆明種（KM）小鼠隨機(jī)分為以下4組：正常對(duì)照組（Control），病毒組（Virus），拘束病毒模型組（Stress+Virus）。RU486組（Stress+Virus+RU486）。小鼠于給藥前1 d開始拘束負(fù)荷，拘束負(fù)荷18 h后第3 d以2×

7、LD50的H1N1病毒感染機(jī)體，實(shí)驗(yàn)組小鼠于拘束負(fù)荷后開始每天皮下注射25 mg/kgRU486，連續(xù)給藥3 d，正常對(duì)照組、病毒組和拘束病毒模型組給予等量溶劑PEG。將小鼠于感染病毒后的第4 d處死取肺組織，檢測(cè)肺組織中MAVS及MAVS聚集體蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，病毒感染增強(qiáng)了小鼠肺組織中MAVS及MAVS聚集體蛋白表達(dá)；與病毒組相比，拘束病毒模型組小鼠肺組織中的MAVS及MAVS聚集體蛋白表達(dá)顯著下降，RU486上調(diào)了兩者蛋

8、白表達(dá)。以上結(jié)果說明應(yīng)激激素CORT能夠通過抑制MAVS蛋白及活性，降低機(jī)體抗病毒信號(hào)。MAVS活化能夠促進(jìn)IRF3磷酸化與NF-κB活化，從而調(diào)控IFN-β應(yīng)答。為了進(jìn)一步考察應(yīng)激誘導(dǎo)的CORT降低IFN-β應(yīng)答提高小鼠流感“易感性”是否受NF-κB調(diào)控，本研究采用NF-κB抑制劑BAY11-7082探討NF-κB信號(hào)通路在CORT負(fù)荷A549細(xì)胞感染流感后對(duì)IFN-β的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與單獨(dú)CORT負(fù)荷細(xì)胞相比，CORT負(fù)荷的A

9、549細(xì)胞感染流感病毒后NF-κB蛋白表達(dá)增強(qiáng)，誘導(dǎo)炎癥因子（TNF-α與 IL-6）釋放增加；與 CORT病毒模型組細(xì)胞相比，NF-κB抑制劑 BAY11-7082顯著降低了細(xì)胞中 NF-κB表達(dá)水平，同時(shí)TNF-α與IL-6釋放減少，提示CORT能直接激活體內(nèi)的NF-κB信號(hào)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。但是BAY11-7082對(duì)CORT負(fù)荷的A549細(xì)胞感染流感病毒后NP與IFN-β表達(dá)無(wú)影響，說明細(xì)胞中IFN-β應(yīng)答受MAVS調(diào)控而與NF-κB

10、信號(hào)通路無(wú)關(guān)。以上結(jié)果表明拘束應(yīng)激負(fù)荷誘導(dǎo)的應(yīng)激激素CORT一方面抑制了MAVS抗病毒信號(hào)通路減少 IFN-β應(yīng)答，另一方面直接激活NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)了炎癥因子釋放，兩者共同作用提高了機(jī)體流感“易感性”。
　　再次，MAVS抗病毒信號(hào)減弱是拘束應(yīng)激負(fù)荷誘導(dǎo)應(yīng)激激素CORT降低流感病毒“易感性”的重要機(jī)制。流感病毒能利用蛋白泛素化途徑調(diào)控機(jī)體先天性免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而線粒體融合蛋白2（Mitofusin2。Mfn2）能夠抑制MAVS

11、抗病毒信號(hào)降低 IFN應(yīng)答促進(jìn)病毒感染。因此，本課題從拘束應(yīng)激負(fù)荷與 CORT負(fù)荷對(duì)小鼠基因表達(dá)譜的影響，與體內(nèi)MAVS泛素化角度研究和探討Mfn2在應(yīng)激激素CORT調(diào)控MAVS泛素化中的作用。（1）首先采用小鼠表達(dá)譜測(cè)序?qū)惺鴳?yīng)激負(fù)荷與CORT負(fù)荷小鼠進(jìn)行基因表達(dá)水平的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CORT負(fù)荷能夠明顯上調(diào)小鼠肺組織中與先天性免疫及抗病毒相關(guān)的Vdac1、Irf3、Mfn2與Jun基因水平，其中Mfn2基因水平顯著上調(diào)，但是MAVS基因水

12、平無(wú)明顯影響，提示拘束應(yīng)激負(fù)荷與CORT負(fù)荷增強(qiáng)機(jī)體易感性可能與Mfn2有關(guān)。接下來(lái)采用RT-PCR與western blot方法檢測(cè)拘束應(yīng)激負(fù)荷與CORT負(fù)荷對(duì)小鼠與A549細(xì)胞中Mfn2與MAVS的基因與蛋白表達(dá)影響。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CORT負(fù)荷能增強(qiáng)Mfn2基因與蛋白表達(dá)，對(duì)MAVS基因表達(dá)無(wú)影響，但是降低MAVS蛋白表達(dá)，提示Mfn2可能與應(yīng)激激素 CORT提高機(jī)體流感“易感性”相關(guān)。（2）采用pIRES2-EGFP-Mfn

13、2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，探討過表達(dá)Mfn2對(duì)流感感染機(jī)體“易感性”的影響。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞經(jīng)CORT負(fù)荷后感染H1N1病毒，觀察細(xì)胞中NP，IFN-β與IFITM3蛋白表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明過表達(dá)Mfn2細(xì)胞感染流感病毒后NP表達(dá)顯著增強(qiáng)，IFN-β與IFITM3蛋白表達(dá)下降，說明應(yīng)激激素CORT上調(diào)了Mfn2表達(dá)從而抑制了IFN-β應(yīng)答。（3）進(jìn)一步考察Mfn2在CORT調(diào)控 MAVS信號(hào)通路降低 IFN-β應(yīng)答中的作用。采用免

14、疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Mfn2與MAVS在體內(nèi)相互作用，結(jié)果證明了Mfn2與MAVS在細(xì)胞體內(nèi)相互結(jié)合。采用Co-IP與western blot法相結(jié)合測(cè)定應(yīng)激激素CORT對(duì)病毒感染小鼠肺組織中MAVS泛素化的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與病毒組相比，拘束應(yīng)激負(fù)荷與CORT負(fù)荷小鼠肺組織中MAVS泛素化顯著增強(qiáng)，以上結(jié)果提示Mfn2可能通過促進(jìn)MAVS泛素化抑制機(jī)體抗病毒信號(hào)通路。（4）采用

15、pIRES2-EGFP-Mfn2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，觀察過表達(dá)Mfn2對(duì)CORT負(fù)荷A549細(xì)胞感染病毒后MAVS泛素化的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Mfn2過表達(dá)促進(jìn)了A549細(xì)胞感染病毒后MAVS泛素化，提示應(yīng)激激素CORT通過上調(diào)Mfn2促進(jìn)了MAVS泛素化降解。
　　最后，考察Mfn2調(diào)控MAVS信號(hào)通路在天然小分子活性肽肌肽（Carnosine）保護(hù)拘束應(yīng)激負(fù)荷小鼠流感感染中的作用研究。課題組前期建立拘束負(fù)荷小鼠流感易感性模型

16、，并用此模型評(píng)價(jià)出了許多天然產(chǎn)物對(duì)流感易感性的保護(hù)作用。其中，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)天然小分子活性肽 carnosine具有抗應(yīng)激與抗氧化等多種生理活性，且能夠提高流感感染小鼠的存活率，但是 carnosine降低流感小鼠易感性是否與Mfn2調(diào)控MAVS信號(hào)通路有關(guān)尚未闡明。（1）采用拘束應(yīng)激負(fù)荷小鼠感染流感病毒，觀察流感小鼠肺指數(shù)、病毒復(fù)制及肺部病理?yè)p傷情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，carnosine顯著降低了拘束負(fù)荷小鼠感染流感病毒后的肺指數(shù)與病

17、毒復(fù)制水平，減輕了肺部病理?yè)p傷。以上結(jié)果說明小分子活性肽 carnosine能夠?qū)α鞲懈腥镜膽?yīng)激負(fù)荷小鼠發(fā)揮保護(hù)作用。（2）探討 carnosine降低拘束應(yīng)激負(fù)荷小鼠流感易感性是否與影響 MAVS抗病毒信號(hào)通路有關(guān)。觀察應(yīng)激負(fù)荷小鼠感染流感后肺組織中IFN-β應(yīng)答與MAVS、p-IRF3、NF-κB與p-IκB蛋白表達(dá)變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組相比，carnosine增強(qiáng)了流感小鼠肺組織中 IFN-β與IFITM3蛋白表達(dá)，上調(diào)

18、了MAVS與p-IRF3蛋白表達(dá)水平，同時(shí)降低了NF-κB與p-IκB蛋白水平。以上結(jié)果說明carnosine能夠激活MAVS抗病毒信號(hào)通路促進(jìn)IFN-β應(yīng)答從而降低機(jī)體流感易感性。（3）探討Mfn2調(diào)控MAVS抗病毒活性在 carnosine降低機(jī)體流感易感性中的作用。觀察應(yīng)激負(fù)荷小鼠感染流感后肺組織中MAVS與MAVS聚集體及Mfn2蛋白表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組相比，carnosine提高了流感小鼠肺組織中MAVS與MAVS