αSNAP調(diào)控重癥急性胰腺炎大鼠腸道緊密連接損傷的機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是臨床上常見(jiàn)的危急重癥，起病急、進(jìn)展快、病死率高。在其發(fā)病早期，可出現(xiàn)MODS(multiple organ dysfunctionsyndrome)和SIRS（systemic inflammatory response syndrome）等嚴(yán)重并發(fā)癥。研究表明，SAP早期除了胰腺局部損傷外，同時(shí)伴隨大量細(xì)胞因子產(chǎn)生、激活和釋放，造成腸道緊密

2、連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin等表達(dá)下降，促使腸道通透性增加，腸源性感染加重，誘發(fā)和加重全身并發(fā)癥。研究證實(shí)可溶性NSF附著蛋白α(α-SNAP)可調(diào)節(jié)包括Occludin、Claudin蛋白在內(nèi)的腸道緊密連接蛋白的表達(dá)，從而影響腸道通透性。已證實(shí)αSNAP對(duì)AMPK有負(fù)性調(diào)節(jié)作用。本研究擬通過(guò)構(gòu)建重癥急性胰腺炎模型，檢測(cè)重癥急性胰腺炎時(shí)，AMPK對(duì)腸道緊密連接蛋白的調(diào)節(jié)關(guān)系，進(jìn)而影響腸道通透性的變化，為重癥急性胰腺炎腸道屏障的保護(hù)提供理

3、論依據(jù)。
　　方法:
　　1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　SD大鼠共30只，隨機(jī)分為5組，每組6只。分別給予腹腔注射20％濃度的L-精氨酸溶液2.0g/kg來(lái)誘導(dǎo)重癥急性胰腺炎（SAP組），共3組，輕癥急性胰腺炎(MAP組)1組，給予注射1.0g/kg誘導(dǎo)，對(duì)照組給予腹腔注射等量生理鹽水。誘導(dǎo)成功后，將3個(gè)SAP組隨機(jī)分為重癥Compound C組（Com組）、重癥Glucosamine組(Gln組)和重癥對(duì)照組（SAP組）。Con

4、組給予Compound C溶液2 ml灌胃，濃度為10 nm/L，每隔8h一次。Gln組給予谷氨酰胺溶液2 ml灌胃，濃度為1 g/kg體重·天，每隔8h一次。在最后一次注射后的24h和48h分別處死各組大鼠的一半，對(duì)大鼠胰腺和小腸上皮做HE染色，觀察其病理變化，并進(jìn)行病理評(píng)分。通過(guò)檢測(cè)腸道漏出的FITC-dextran的量，間接反映腸道通透性的變化。用免疫組化和westem blot檢測(cè)AMPK、αSNAP和occludin表達(dá)水平的

5、變化。
　　2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　小腸上皮細(xì)胞HIEC轉(zhuǎn)染αSNAP shRNA慢病毒;通過(guò)Western blot檢測(cè)細(xì)胞AMPK、αSNAP和occludin蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　1)胰腺組織病理:胰腺的HE染色中，對(duì)照組無(wú)明顯變化;MAP組大鼠胰腺組織僅見(jiàn)輕微充血，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn);SAP組胰腺大片狀壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯;重癥Con組和重癥Gln組胰腺病理改變明顯輕于SAP組

6、。在24h和48h時(shí)胰腺組織病理評(píng)分分別為:對(duì)照組（0.17±0.26，0.33±0.41）;MAP組（7.00±0.63;6.92±0.81）;SAP組（14.08±0.86;14.67±0.68）;Com組（12.00±0.71;12.50±0.78）; Gln組（12.67±0.88;12.17±0.82）。各組間比較p＜0.05。
　　2)空腸上皮組織病理:光鏡下觀察，對(duì)照組腸黏膜未見(jiàn)明顯損傷，絨毛形態(tài)完整;MAP組腸絨毛

7、稍有縮短;SAP組腸絨毛炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，絨毛形態(tài)不規(guī)則，破壞明顯，黏膜壞死脫落;重癥Con組與重癥Gln組腸黏膜相對(duì)較完整，少量壞死和腸絨毛縮短。在24h和48h小腸上皮組織病理評(píng)分分別為:對(duì)照組(1;1); MAP組（1.83±0.75;2.00±0.63）;SAP組（3.50±0.55;4.33±0.52）;Com組（3.00±0.63;3.33±0.52）; Gln組（3.00±0.63;3.50±0.55）。各組間比較p＜0.05

8、。
　　3)腸道通透性檢測(cè):SAP組大鼠的腸道通透性升高明顯，重癥Com組與重癥Gln組的腸道通透性相對(duì)SAP組有所回復(fù)。24h和48h滲透出的FITC-dextran熒光值:對(duì)照組（0.22±0.14;0.51±0.61）;MAP組（99.59±5.34;102.42±5.26）;SAP組（394.17±19.93;410.25±7.80）; Com組（363.00±18.45;372.95±9.33）; Gln組（351.08

9、±17.69;367.93±18.90）。各組間比較p＜0.05。
　　4)免疫組化法(IHC)檢測(cè)腸上皮細(xì)胞蛋白表達(dá):SAP組大鼠相對(duì)于對(duì)照組和MAP組，腸上皮細(xì)胞AMPK蛋白表達(dá)升高，occludin和αSNAP蛋白表達(dá)降低;Com組和Gln組相對(duì)SAP組，腸上皮細(xì)胞中AMPK表達(dá)降低，occludin和αSNAP表達(dá)增高。
　　5)免疫印跡(Western blot)檢測(cè)腸上皮緊密連接蛋白表達(dá):檢測(cè)造模后48h處死大鼠

10、的腸上皮細(xì)胞，結(jié)果與免疫組化結(jié)果基本一致，SAP組大鼠腸上皮細(xì)胞AMPK表達(dá)升高，occludin和αSNAP表達(dá)降低;Com組和Gln組相對(duì)SAP組，AMPK表達(dá)降低，occludin和αSNAP表達(dá)增高。
　　2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　轉(zhuǎn)染αSNAP shRNA慢病毒后，HIEC細(xì)胞的αSNAP表達(dá)下調(diào)，AMPK表達(dá)上調(diào)，同時(shí)occludin表達(dá)也下調(diào);再向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入Compound C抑制AMPK的表達(dá)，occludin