用于視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞電刺激的石墨烯-聚吡咯納米纖維的制備.pdf

1、實驗?zāi)康?
　　本實驗采用一種簡單高效的邊緣功能化球磨(EFBM)的方法制備了聚吡咯修飾的石墨烯(PPy-G)，同時結(jié)合靜電紡絲技術(shù)制備了聚吡咯石墨烯/聚乳酸-羥基乙酸(PPy-G/PLGA)三維納米纖維，用于視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)電刺激生長。通過進(jìn)一步調(diào)控納米纖維形貌和優(yōu)化電刺激條件，考察了電刺激對培養(yǎng)子纖維支架上的RGCs形貌的變化以及對RGCs特定基因表達(dá)的影響，從而實現(xiàn)RGCs體外的可控生長和神經(jīng)突起再生，為促進(jìn)視神經(jīng)修

2、復(fù)再生和青光眼等重大眼科疾病的臨床治療提供新的思路和方向。
　　實驗方法:
　　本實驗先通過我們自主發(fā)明的EFBM法制備了高導(dǎo)電性、機械穩(wěn)定性良好的PPy-G，再結(jié)合靜電紡絲技術(shù)，分別制備了含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％和6％ PPy-G的無序和定向的PPy-G/PLGA納米纖維。通過拉曼光譜(Raman)，原子力顯微鏡(AFM)，紅外光譜(FTIR)，掃描電子顯微鏡(SEM)，電化學(xué)循環(huán)伏安法等方法對納米纖維的形貌和性能進(jìn)行了表征。最

3、后，將RGCs接種在納米纖維上進(jìn)行培養(yǎng)，利用電化學(xué)工作站，采用±700mV的脈沖電壓，10HZ的頻率電刺激接種于納米纖維支架上的細(xì)胞。通過SEM及對細(xì)胞核和細(xì)胞骨架染色觀察電刺激前后細(xì)胞形貌的變化及細(xì)胞突觸的延伸情況，從而分析電刺激對生長于PPy-G/PLGA納米纖維支架上的RGCs的影響。
　　實驗結(jié)果:
　　1.球磨法制備的PPy-G的表征結(jié)果:
　　AFM、Raman、FTIR等表征圖表明制備的PPy-G為納米厚

4、度，分散均一，且具有聚吡咯的特征峰。CV圖顯示制備的PPy-G電化學(xué)性能良好。CCK-8實驗表明了PPy-G具有良好的生物相容性。
　　2.靜電紡絲法制備的PPy-G/PLGA納米纖維支架的表征結(jié)果:
　　(1) PPy-G/PLGA納米纖維的掃描電鏡(SEM)圖表明，在合適的濃度范圍內(nèi)所制備的納米纖維直徑比較均一，形貌光滑，沒有小液滴出現(xiàn);所制備的定向納米纖維排列整齊有序，非定向纖維密集交錯。所制備的納米纖維的直徑隨著所添

5、加的PPy-G的濃度的不同而改變。
　　(2)電化學(xué)循環(huán)伏安(CV)圖:CV結(jié)果顯示，純的PLGA的CV圖上幾乎沒有氧化還原峰，說明PLGA沒有電化學(xué)活性;摻入PPy-G后，出現(xiàn)明顯的氧化還原峰，電化學(xué)活化面積變大，說明納米纖維支架的電化學(xué)活性明顯增強，所制備的納米纖維具有很好的電刺激能力。
　　(3)拉曼光譜（Raman）和傅里葉紅外光譜(FTIR)圖:Raman測得PPy-G/PLGA納米纖維在1350nm和1580nm

6、具有石墨烯的D峰和G峰等特征峰，F(xiàn)TIR圖顯示納米纖維中具有聚吡咯基團的特征峰。這兩者均證明了PPy-G在納米纖維中的存在。
　　3.視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)電刺激結(jié)果:
　　(1)對細(xì)胞核和細(xì)胞骨架染色結(jié)果:通過比較在±100mV，±400mV，±700mV和±1000mV的電壓下電刺激RGCs后的細(xì)胞熒光染色圖，發(fā)現(xiàn)當(dāng)電刺激電壓為±700mV時細(xì)胞的形貌及生長狀況最好。
　　(2)共聚焦顯微鏡(CM)及SEM圖

7、:在±700mV電壓條件下電刺激細(xì)胞后，RGCs的神經(jīng)突觸有一定的伸長。生長于定向PPy-G/PLGA納米纖維上的細(xì)胞沿著纖維延伸的方向整齊排列，電刺激后細(xì)胞長度伸長了137％，證明了電刺激對RGCs的生長具有顯著的促進(jìn)作用。
　　(3) RT-PCR結(jié)果:
　　RT-PCR檢測結(jié)果表明，與RGCs細(xì)胞神經(jīng)突觸生長相關(guān)的基因BDNF、Thy-1電刺激后表達(dá)量上調(diào)，P53和其他與凋亡有關(guān)的基因表達(dá)量下調(diào)，進(jìn)一步證明了電刺激促進(jìn)

8、了RGCs神經(jīng)突觸的生長，對RGCs細(xì)胞有一定的抗凋亡作用。
　　實驗結(jié)論;
　　本研究采用邊緣功能化球磨法成功合成了PPy-G，并通過高壓靜電紡絲技術(shù)，制備了PPy-G/PLGA納米纖維支架，用于電刺激RGCs細(xì)胞的生長。研究結(jié)果表明，接種于納米纖維支架上的RGCs細(xì)胞會沿著納米纖維延伸的方向生長，電刺激后RGCs細(xì)胞延伸顯著，表明電刺激能夠有效提高RGC細(xì)胞活性和再生，為視神經(jīng)修復(fù)再生和青光眼等重大眼科疾病的治療提供了潛