Smad泛素化調(diào)節(jié)因子2在TGFβ1誘導(dǎo)人肺成纖維細(xì)胞活化中的作用及其分子機(jī)制.pdf

1、肺纖維化是以成纖維細(xì)胞過度增殖、活化、細(xì)胞外基質(zhì)（extracelluar matrix，ECM）沉積，并伴有炎癥和損傷所致組織結(jié)構(gòu)破壞和功能喪失為共同病理特征的一組彌漫性肺疾病。轉(zhuǎn)化生長因子β1(Transforming growth factorβ1，TGF-β1)是一種多功能的細(xì)胞因子，也是迄今為止最強(qiáng)的致纖維化因子。Smad信號通路是TGF-β超家族成員通過胞膜上的特異性受體將信號傳遞至核內(nèi)的主要的、中樞性的傳遞分子。TGF-β

2、1/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中，具有關(guān)鍵而重要的作用，包括趨化和活化炎性細(xì)胞，介導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，促進(jìn)成纖維細(xì)胞活化、增殖，以及刺激細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的合成及促進(jìn)其沉積。
　　泛素-蛋白酶體通路（Ubiquitin Proteasome Pathway，UPP）是一個調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)降解與功能的重要系統(tǒng)，在細(xì)胞內(nèi)普遍存在，參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗原提呈等多種生理過程，對維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)具有

3、十分重要的意義，其功能的改變和異常能直接導(dǎo)致或誘發(fā)人類的許多重要疾病。UPP中E3泛素連接酶促使泛素和特異性蛋白相結(jié)合，使靶蛋白泛素化降解，決定了降解底物蛋白的特異性和高度選擇性，因此在UPP中起著決定性作用。Smad泛素化調(diào)節(jié)因子（Smad ubiquitination regulatory factor，Smurf）是一種含HECT結(jié)構(gòu)域的E3泛素連接酶，包括Smurf1和Smurf2。
　　Smurfs通過選擇性介導(dǎo)Smad

4、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵組分的降解，從而在TGF-β1信號活性的調(diào)節(jié)中起樞紐作用，一旦功能失調(diào)，會導(dǎo)致異常的TGF-β1/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并導(dǎo)致一系列病理生理學(xué)改變。近年來研究表明。Smurf2通過選擇性介導(dǎo)c-Ski、SnoN、Smad7、Smad2和TβRI等蛋白的降解而參與調(diào)節(jié)TGF-β1/Smads信號通路，參與肝、腎、皮膚纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展。目前Smurfs在肺纖維化中的作用尚不清楚。
　　目的:探討Smurf2在 TG

5、F-β1誘導(dǎo)人肺成纖維細(xì)胞活化中的作用及可能的分子機(jī)制
　　方法:（1）體外培養(yǎng)人肺成纖維細(xì)胞MRC-5。(2)以人肺成纖維細(xì)胞MRC-5為研究對象，隨機(jī)分為4組：其中三組分別加入外源性TGF-β1（10μg·L-1）作用1、2和6 h后（分別為TGF-β11 h、TGF-β12 h和TGF-β16 h組），另一組設(shè)為對照組（不加TGF-β1）。RT-PCR和Western blotting法分別檢測各組細(xì)胞中Smurf1和Smu

6、rf2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。（3）采用siRNA干擾技術(shù)沉默人肺成纖維細(xì)胞中Smurf2的基因表達(dá)：體外培養(yǎng)MRC-5細(xì)胞，隨機(jī)分為對照組（未加入TGF-β1或siRNA）、TGF-β1組（10μg·L-1 TGF-β1）、Control siRNA轉(zhuǎn)染組（10μg·L-1TGF-β1+Control siRNA）和Smurf2 siRNA轉(zhuǎn)染組（10μg·L-1 TGF-β1+Smurf2 siRNA）。（4）Western b

7、lotting法檢測各組細(xì)胞中α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）和I型膠原α1（COL1A1）的表達(dá)水平；（5）RT-PCR和Western blotting法分別檢測各組細(xì)胞中Smad7、核轉(zhuǎn)錄共抑制因子SnoN、TGF-βI型受體（TβRI）、Smad2和Smad3 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:（1）與對照組比較，各TGF-β1組細(xì)胞中Smurf2 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯升高（P<0.05），且隨著TGF-β1作

8、用時間的延長，其表達(dá)水平呈逐漸增加的趨勢；（2）與對照組比較，各TGF-β1組細(xì)胞中Smurf1表達(dá)水平無明顯變化（P>0.05）。（3）與TGF-β1組比較，Smurf2 siRNA組細(xì)胞中Smurf2蛋白表達(dá)水平下降（P<0.05）。（4）與對照組比較，TGF-β1組細(xì)胞中α-SMA和COL1A1蛋白表達(dá)水平均明顯升高（P<0.05）；（5）與TGF-β1組比較，Smurf2 siRNA組細(xì)胞中α-SMA和COL1A1蛋白表達(dá)水平均

9、下降（P<0.05）。（6）與對照組比較，TGF-β1組和Smurf2 siRNA組細(xì)胞中Smad7和SnoN mRNA表達(dá)水平均升高（P<0.05），而Smurf2siRNA組與TGF-β1組細(xì)胞中Smad7和SnoN mRNA表達(dá)水平比較無明顯變化（P>0.05）。（7）與對照組比較，TGF-β1組細(xì)胞中Smad7和SnoN蛋白表達(dá)水平均有所下降（P<0.05）；（8）與TGF-β1組比較，Smurf2 siRNA組細(xì)胞中Smad7

10、和SnoN蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05）。（9）與對照組比較，TGF-β1組和Smurf2 siRNA組細(xì)胞中TβRI mRNA和蛋白表達(dá)水平均升高（P<0.05），而Smurf2 siRNA組與TGF-β1組細(xì)胞中TβRI mRNA和蛋白表達(dá)水平比較無明顯變化（P>0.05）。（10）各組細(xì)胞中Smad2和Smad3 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較無明顯變化（P>0.05）。
　　結(jié)論:
　?。?）體外，TGF-β1促進(jìn)人肺