擴張器包膜培育帶蒂膀胱平滑肌瓣的實驗研究.pdf

1、目的:
　　構(gòu)建與知名血管相連通的擴張器包膜血管床，向該血管床上反復(fù)多次移植共培養(yǎng)膀胱平滑肌細(xì)胞片（含內(nèi)皮祖細(xì)胞），在體培育軸型血管化逼尿肌組織瓣，進(jìn)而帶血管蒂移植至膀胱壁漿肌層缺損區(qū)，為解決組織工程組織的血供難題開拓新的途徑。
　　方法:
　　1.選取新西蘭兔為實驗動物，將旋髂淺動靜脈束（SCI）的起始段從腹股溝脂肪墊中分離出來，貼置于腹前壁肌層表面，挨著游離出來的SCI埋置皮膚擴張器，間歇性注水?dāng)U張2周和6周后，形

2、成以SCI為軸心血管的島狀包膜瓣，通過島狀包膜瓣的熒光素鈉顯色和向島狀包膜瓣上移植皮片，來研究軸型包膜瓣作為新型血管載體的可行性，同時對包膜瓣進(jìn)行組織學(xué)觀察。
　　2.通過向兔膀胱壁漿膜下推注生理鹽水及鈍性分離的方法直接從膀胱壁上獲取單純的逼尿肌組織塊，來培養(yǎng)膀胱平滑肌細(xì)胞（BSMC）。采集外周血，密度梯度離心法分離培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）。BSMC與EPC按不同細(xì)胞數(shù)比例混合后，共同接種于聚苯乙烯培養(yǎng)皿內(nèi)，待細(xì)胞增殖至融合后，胰

3、酶消化收集另一份BSMC與EPC，按同樣細(xì)胞數(shù)比例混合，進(jìn)行CM-DiI標(biāo)記，共同接種至培養(yǎng)皿內(nèi)融合細(xì)胞層上，繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)紅色熒光范圍擴展至整個皿底時，用移液槍頭在細(xì)胞層邊緣劃痕，然后，嘗試用移液槍頭推撥細(xì)胞層的方法來收獲共培養(yǎng)膀胱平滑肌細(xì)胞片。臺盼藍(lán)拒染法檢測細(xì)胞片的細(xì)胞成活率，激光共聚焦顯微鏡測量融合細(xì)胞層及細(xì)胞片的厚度，選取兩張自體細(xì)胞構(gòu)建的細(xì)胞片植入兔體內(nèi)預(yù)構(gòu)的血管床上進(jìn)行孵育，4周后切取細(xì)胞片組織，進(jìn)行組織學(xué)觀察。
　　

4、3.旁開SCI2cm處的包膜上作平行于SCI的包膜切口，于腹壁肌層表面銳性分離，使范圍4cm×4cm的包膜區(qū)域與腹壁肌層分開，以新形成的包膜面作為接納細(xì)胞片的血管床。為保證能反復(fù)多次向包膜受床上添加細(xì)胞片，特制一個凹槽形鈦網(wǎng)支架以撐起包膜。每兩天，用細(xì)胞鏟將兩張已標(biāo)記CM-DiI的共培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞片轉(zhuǎn)移至包膜血管床上，共進(jìn)行五次細(xì)胞片植入手術(shù)。
　　4.最后一次植入細(xì)胞片后2周和4周，切取薄層包膜及其上的細(xì)胞片組織，制作冰凍切片、

5、石蠟切片和電鏡切片，進(jìn)行細(xì)胞片組織的組織學(xué)觀察。同時對細(xì)胞片組織進(jìn)行器官浴槽實驗，觀察有無收縮功能。在此基礎(chǔ)上，以SCI為軸心血管，形成島狀包膜-細(xì)胞片組織瓣，經(jīng)腹壁肌層和漿膜切口，帶蒂移植至膀胱壁漿肌層缺損，3個月后，切取移植的細(xì)胞片組織進(jìn)行組織檢測。
　　結(jié)果:
　　1.擴張器注水?dāng)U張2周與6周后，均有完整的包膜形成，肉眼觀察，SCI兩旁包膜內(nèi)小血管叢平均寬度分別為1.8±0.3mm（2周組）與4.1±0.5mm（6周組

6、）（P＜0.05），島狀包膜瓣內(nèi)，熒光素鈉顯色范圍與肉眼所見的小血管叢分布范圍一致，島狀包膜瓣上移植的皮片完全成活，HE、Masson染色及CD31免疫組化染色顯示包膜內(nèi)富含膠原纖維與小血管，無肌纖維成分。
　　2.新的逼尿肌取材方法及傳統(tǒng)活檢取材方法所培養(yǎng)的P2代BSMC的純度分別為97.09±0.66%與83.92±2.58%（P<0.01），兩種取材方法獲得單純逼尿肌組織塊耗費的時間分別為3±0.8 min與5±1.3min

7、（P<0.01）。當(dāng)BMSC:EPC=4:1或6:1時，全部12個普通培養(yǎng)皿內(nèi)均能以槍頭推撥細(xì)胞層的方法收獲到完整細(xì)胞片；當(dāng)BMSC:EPC=8:1時，收獲完整細(xì)胞片的成功率為6/8。隨機選取的3張細(xì)胞片的細(xì)胞成活率分別為97.4%，98.6%與98.7%。單層、復(fù)層細(xì)胞層及自然收縮的細(xì)胞片的平均厚度見第三章表1，三種不同SMC與EPC混合比例的單層細(xì)胞層之間、復(fù)層細(xì)胞層之間以及細(xì)胞片之間，平均厚度均沒有顯著差異（P>0.05）。細(xì)胞片

8、在體內(nèi)孵育4周后，仍見紅色熒光，HE及α-SMA染色顯示植入的細(xì)胞片在體內(nèi)形成了含新生小血管的平滑肌組織。
　　3.植入的細(xì)胞片緊貼于包膜血管床上，顏色淡紅，走行于血管床中軸線的SCI搏動明顯，細(xì)胞片表面朝向腔隙，未與其他組織接觸，包膜無水腫或蒼白壞死。細(xì)胞片在包膜血管床上孵育2周后，冰凍切片顯示包膜表面有一層紅色熒光分布區(qū)，α-SMA免疫組化染色顯示包膜表面有一層棕黃色沉淀，HE及Masson染色顯示平滑肌細(xì)胞形態(tài)不典型，細(xì)胞排

9、列紊亂，有較多炎癥細(xì)胞及膠原纖維，器官浴槽實驗中，細(xì)胞片組織條無收縮反應(yīng)。細(xì)胞片在包膜血管床上孵育4周后，平滑肌細(xì)胞呈典型的長梭形，細(xì)胞密集，排列整齊，器官浴槽實驗中，構(gòu)建組織表現(xiàn)出與正常膀胱平滑肌類似的收縮功能，去氧腎上腺素和氯化鉀刺激所誘導(dǎo)的最大收縮力分別為2.37±0.61 g和1.95±0.52 g，電鏡切片觀察到細(xì)胞內(nèi)有密斑、密體結(jié)構(gòu)，細(xì)胞間有縫隙連接形成。
　　4.島狀組織瓣帶蒂移植至膀胱壁后7天，組織瓣邊緣顏色粉紅，

10、血管蒂搏動明顯；移植術(shù)后3個月，HE、Masson及α-SMA染色顯示，軸型包膜瓣攜帶的共培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞片已在膀胱受區(qū)形成典型的膀胱平滑肌組織形態(tài)。
　　結(jié)論:
　　1.貼著SCI埋置擴張器并注水?dāng)U張一段時間后，SCI起始段與其兩旁的包膜內(nèi)新生小血管間建立起有效的血管連接，兩者共同構(gòu)成含軸心血管的包膜血管床。
　　2.與傳統(tǒng)的活檢取材方法相比，新的逼尿肌取材方法能明顯提高所培養(yǎng)的BSMC的純度，且操作更簡便。
　

11、　3.通過在BSMC與EPC融合細(xì)胞層上再次接種該兩種細(xì)胞的方法，可以在培養(yǎng)皿內(nèi)形成復(fù)層細(xì)胞層，用移液槍頭劃痕細(xì)胞層邊緣和推移細(xì)胞層，能直接從普通培養(yǎng)皿內(nèi)收獲厚的共培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞片，且該細(xì)胞片能用于構(gòu)建血管化平滑肌組織。
　　4.在包膜與腹壁肌層之間分離腔隙并置入凹槽形鈦網(wǎng)支架，使得包膜血管床朝向剝離腔隙，而不會接觸體內(nèi)組織，保證能反復(fù)多次添加細(xì)胞片至包膜血管床上，逐步增加細(xì)胞片組織的厚度。
　　5.含軸心血管的包膜血管床能