應(yīng)用自制組織芯片研究葉酸受體β在結(jié)核肉芽腫中的表達(dá)中的意義.pdf

1、目的：結(jié)核病是世界上第二大傳染病，2014年結(jié)核病新發(fā)病例960萬，死亡150萬，新發(fā)病例中有120萬為HIV陽性，48萬為耐多藥結(jié)核，耐多藥結(jié)核中的9％為廣泛耐藥結(jié)核，也就是說，約有5萬結(jié)核患者在目前醫(yī)療條件下無法治療。在中低收入的國家中，2015年結(jié)核病的總負(fù)擔(dān)為80億美元。2014年5月19日，WHO在世界衛(wèi)生大會(huì)上通過了―在2015年后的全球結(jié)核預(yù)防、治療和控制的策略和目標(biāo)，目標(biāo)是結(jié)束全球結(jié)核病疫情，2035年達(dá)到結(jié)核病死亡數(shù)目

2、減少95%，發(fā)生率降低到90%的目標(biāo)，同時(shí)使結(jié)核病罹患家庭免受災(zāi)難性的花費(fèi)。隨著耐多藥結(jié)核和免疫相關(guān)疾病伴發(fā)結(jié)核病和免疫制劑使用者結(jié)核病的產(chǎn)生，受近幾十年的化學(xué)治療抑制的結(jié)核疫情大有死灰復(fù)燃之際，這給了廣大的醫(yī)務(wù)工作者對結(jié)核的治療又有了新的挑戰(zhàn)；同時(shí)世界上有1/3的人感染過結(jié)核桿菌，而僅有5-10%的感染者發(fā)展為結(jié)核病病人，其他以潛伏感染的形式寄生在人體當(dāng)中，一但因?yàn)楦鞣N原因?qū)е聶C(jī)體免疫力下降，就有可能導(dǎo)致體內(nèi)的結(jié)核桿菌失控，而造成結(jié)核

3、病的發(fā)生。病理組織芯片是由數(shù)十至上千個(gè)組織整齊地排列在一張載玻片上而制成的組織芯片，是已經(jīng)應(yīng)用于腫瘤分子病理學(xué)研究的技術(shù)，最早在1998年由Kononen等報(bào)告，當(dāng)時(shí)主要用病理組織芯片進(jìn)行腫瘤組織中的DNA、RNA和蛋白質(zhì)的原位測定和分析，后逐漸拓展到組織染色，熒光染色，病理教學(xué)，病理標(biāo)準(zhǔn)化培訓(xùn)和測定，原位雜交和熒光原位雜交。特別是生物芯片信息計(jì)算機(jī)處理系統(tǒng)的產(chǎn)生，病理組織芯片已經(jīng)可以使用計(jì)算機(jī)自動(dòng)分析。與傳統(tǒng)的病理切片相比，病理組織芯

4、片可以大量的快速自動(dòng)化處理，這樣可以大大減少人工，同時(shí)大量病理組織在相近的條件下進(jìn)行病理識別處理，使診斷過程更標(biāo)準(zhǔn)化。病理組織芯片提高效率、明確診斷的同時(shí)，還可以測量病變組織中的特異的基因，mRNA和蛋白質(zhì)等物質(zhì)的特異性改變，同時(shí)減少了組織需要量，一次實(shí)驗(yàn)即可獲得大量結(jié)果。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)核病理組織芯片的制作和應(yīng)用，本研究試圖通過收集一定數(shù)量的病理確診結(jié)核病例手術(shù)中的病灶組織，制成結(jié)核病理芯片。并使用該病理芯片作為研究結(jié)核

5、病的平臺，研究結(jié)核病變組織原位的細(xì)胞因子與結(jié)核桿菌感染狀態(tài)的關(guān)系，結(jié)核病變特異性基因變化情況，以及結(jié)核病灶巨噬細(xì)胞的變化情況等，并為結(jié)核病診斷、治療，后期體外模型和體內(nèi)模型實(shí)驗(yàn)提供理論依據(jù)。
　　方法：⑴收集2015年5月至2016年12月在復(fù)旦大學(xué)附屬上海市公共衛(wèi)生中心胸外科住院、確診并手術(shù)的患者50例作為實(shí)驗(yàn)組，其中男性27例，女性23例，平均年齡33歲，其中淋巴結(jié)核18例，骨關(guān)節(jié)結(jié)核12例，椎體結(jié)核11例，胸壁結(jié)核2例，結(jié)核

6、性胸膜炎或肺結(jié)核7例。術(shù)前抗結(jié)核治療0-96個(gè)月，排除合并有腫瘤患者。嚴(yán)格遵循外科無菌原則行結(jié)核病灶清除術(shù)，在已切除的標(biāo)本中在無菌條件下進(jìn)行組織收集，包括結(jié)核病灶的壞死肉芽腫組織及臨近正常組織，術(shù)后進(jìn)行常規(guī)病理檢測，僅保留術(shù)后病理抗酸桿菌染色陽性的組織入組。同時(shí)收集患者臨近正常組織（距結(jié)核病灶邊緣3cm以上的正常組織）50例作為陰性對照組。陽性對照組為正常人的脾臟組織（脾破裂等無其他脾臟疾病者）50例，其中男性36例，女性14例，平均年

7、齡29歲。生理鹽水凍存管50例作為空白對照組。⑵應(yīng)用自制組織芯片技術(shù)將4組標(biāo)本分別按陣列設(shè)計(jì)順序依次放入受體蠟塊中，融合、切片、撈片、烤片制成需要的組織芯片。⑶將制成的病理組織芯片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，應(yīng)用共聚焦顯微鏡檢測病理組織芯片中Frβ等物質(zhì)的變化情況，分別對得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，觀察結(jié)核肉芽腫，病變周邊組織及臨近正常組織得出結(jié)核感染狀態(tài)和 Frβ等物質(zhì)的變化關(guān)系，所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，以P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)

8、學(xué)差異。
　　結(jié)果：①形態(tài)學(xué)檢查：病理芯片由于切片較小，理論上有一定的信息缺失，但實(shí)際觀察與傳統(tǒng)病理切片差距不大。實(shí)驗(yàn)組與傳統(tǒng)病理結(jié)果的符合率98%，其中有一例頸部腫物與傳統(tǒng)病理不符合。②對收集的病人組織病理資料制作成病理組織芯片，其中FRβ、結(jié)核抗體在結(jié)核分枝桿菌反應(yīng)性巨噬細(xì)胞中的含量，與陰性對照組相比明顯增加（P<0.05）。
　　結(jié)論：⑴.成功制作第一種結(jié)核病理組織芯片，結(jié)核病理組織芯片制作簡單易行，有望成為一種新型的