黃酮調(diào)控乳腺癌細胞內(nèi)NO和ROS水平影響DLC1-RhoA信號通路的研究.pdf

1、RhoGTP酶家族是肌動蛋白骨架的關鍵調(diào)控因子，是一類GTP/GDP分子開關蛋白，結合GTP時為活化狀態(tài)，結合GDP時為失活狀態(tài)。RhoA是RhoGTP酶家族最具典型特征的成員之一。腫瘤抑制蛋白DLC1（Deleted in Liver Cancer1）是RhoGAP（RhoGTPase-activating protein）家族成員之一，催化其下游靶蛋白RhoA從RhoA-GTP狀態(tài)轉變?yōu)镽hoA-GDP狀態(tài)，使RhoA失活。DLC1

2、蛋白在細胞內(nèi)不穩(wěn)定，在多種癌癥中低表達或缺失。
　　一氧化氮（NO）和活性氧（ROS）在細胞內(nèi)發(fā)揮信號分子的功能，參與調(diào)控多種細胞信號轉導途徑。NO由一氧化氮合酶（NOS）合成，在細胞內(nèi)通過誘導蛋白質(zhì)亞硝基化（S-nitrosylation）調(diào)控一系列細胞生理進程。亞硝基化是一種可逆的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，通過一個NO基團與半胱氨酸殘基上的反應性的硫醇基團結合，形成亞硝基硫醇（S-nitrosothiol）。有報道指出NO影響RhoA

3、的活力。ROS調(diào)控成纖維細胞RhoA活力，該過程不依賴于RhoGEF或RhoGAP。ROS調(diào)控RhoGAP家族成員p190Rho-GAP和Cdc42GAP。
　　黃酮（2-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one），是黃酮類化合物的母核結構，抑制結腸癌和乳腺癌細胞增殖。已有報道指出，黃酮調(diào)控小鼠巨噬細胞和大鼠肝細胞內(nèi)NO水平，影響斑馬魚胚胎、肝癌和結腸癌細胞內(nèi)ROS水平，上調(diào)乳腺癌細胞DLC1的mRNA表達水平。<

4、br>　　本文探究了黃酮對乳腺癌細胞DLC1/RhoA信號通路的調(diào)控作用，黃酮對NO和ROS相關生理進程的影響及機制，以及黃酮對DLC1/RhoA信號通路的調(diào)控是否經(jīng)NO或ROS介導。
　　MTT和Hoechst-PI核熒光染色實驗顯示，黃酮以劑量和時間依賴性的方式抑制乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞增殖，誘導細胞凋亡，但是不引起細胞壞死。黃酮上調(diào)兩種乳腺癌細胞系DLC1蛋白表達水平。蛋白酶體抑制劑MG132處理提高了D

5、LC1蛋白水平，蛋白合成抑制劑放線菌酮（CHX）處理導致DLC1蛋白水平迅速降低，黃酮與CHX共同處理降低了DLC1的降解速率，說明黃酮抑制DLC1經(jīng)蛋白酶體途徑的降解，提高DLC1蛋白穩(wěn)定性。
　　黃酮抑制乳腺癌細胞NOS活力，該抑制作用依賴于完整的亞細胞結構。熒光顯微術和流式細胞術兩種方法的結果顯示，黃酮降低乳腺癌細胞內(nèi)NO水平。本文探究了黃酮對蛋白質(zhì)亞硝基化的影響。基于“Biotin-switch”法，將細胞內(nèi)蛋白質(zhì)所有亞硝

6、基化位點標記上馬來酰亞胺生物素（maleimide-biotin），再借助鏈親和素磁珠純化蛋白。實驗結果顯示，黃酮下調(diào)乳腺癌細胞內(nèi)蛋白質(zhì)亞硝基化修飾水平。
　　為了探究黃酮抑制乳腺癌細胞增殖和上調(diào)DLC1的作用是否經(jīng)NO介導，在黃酮處理后，使用NO供體硝普鈉（SNP）恢復被黃酮下調(diào)的NO水平。經(jīng)MTT實驗檢測發(fā)現(xiàn)，硝普鈉在一定程度上逆轉了黃酮對MCF-7細胞增殖的抑制作用，表明黃酮通過下調(diào)乳腺癌細胞內(nèi)NO水平抑制細胞增殖。而wes

7、tern blot實驗結果顯示，NO水平的恢復不影響DLC1的蛋白表達水平，證明黃酮對DLC1的調(diào)控作用不通過NO介導。
　　本文探究了黃酮對乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞ROS水平的調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)黃酮通過提高超氧化物歧化酶（SOD）活力而降低細胞內(nèi)ROS水平。為了探究黃酮對DLC1/RhoA信號通路的調(diào)控作用是否經(jīng)ROS介導，本文使用過氧化氫處理，恢復被黃酮降低的ROS水平。因為ROS的作用具有濃度依賴性，癌細胞內(nèi)R

8、OS處于生理水平時發(fā)揮信號轉導分子的作用；而當ROS水平過高時， ROS將會造成細胞損傷和死亡。本研究的目的是探究生理范圍內(nèi) ROS對DLC1/RhoA信號通路的調(diào)控作用，所以，首先對過氧化氫的使用濃度進行篩選，使過氧化氫將黃酮處理組細胞內(nèi)ROS水平恢復至接近對照組的水平。根據(jù)實驗結果，選擇使用40μM過氧化氫恢復被黃酮降低的ROS水平。
　　實驗結果顯示，150和200μM黃酮處理乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞24和

9、72小時，上調(diào)DLC1蛋白表達水平，過氧化氫抑制被黃酮上調(diào)的DLC1水平，表明黃酮通過下調(diào)ROS而上調(diào)DLC1。Pull-down檢測顯示，150和200μM黃酮處理MCF-7和MDA-MB-231細胞24小時，抑制RhoA活力，而過氧化氫逆轉了被黃酮下調(diào)的RhoA-GTP水平。劃痕實驗顯示，黃酮對乳腺癌細胞遷移的抑制也被過氧化氫抵消。上述結果說明，黃酮通過下調(diào)乳腺癌細胞ROS水平，進而調(diào)控DLC1/RhoA信號通路，抑制乳腺癌細胞遷移

10、。
　　本文證明黃酮抑制乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞增殖，并誘導凋亡，上調(diào)DLC1蛋白表達水平，提高DLC1蛋白穩(wěn)定性。黃酮通過抑制NOS活力而降低細胞內(nèi)NO水平，進而下調(diào)蛋白質(zhì)亞硝基化修飾水平。黃酮通過下調(diào)NO水平抑制乳腺癌細胞增殖，而黃酮對DLC1的調(diào)控作用不經(jīng)過NO介導。黃酮通過上調(diào)SOD活力而降低乳腺癌細胞ROS水平。使用外源過氧化氫處理恢復被黃酮下調(diào)的ROS水平后，黃酮誘導的DLC1蛋白表達水平的上調(diào)，以及