重組螢火蟲熒光素酶及其穩(wěn)定性研究.pdf

1、重組螢火蟲熒光素酶及其穩(wěn)定性研究rn’。n一一1hereaserchofrecombinantluciferaseanditsstability學(xué)科專業(yè)研究生學(xué)號(hào)指導(dǎo)教師生物分子工程劉艷杰2008207381黃鶴副教授天津大學(xué)化工學(xué)院二零一零年六月&&◆‘摘要熒光素酶是由一條多肽鏈組成的高效生物催化劑。在ATP、M92、02等適宜的條件下，能夠以熒光素為底物發(fā)生催化反應(yīng)并發(fā)出熒光。鑒于上述特點(diǎn)，熒光素酶在諸多領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用，本文旨在

2、實(shí)現(xiàn)重組螢火蟲熒光素酶的國(guó)產(chǎn)化規(guī)模生產(chǎn)并對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行研究。本課題首先通過(guò)PCR擴(kuò)增技術(shù)獲得熒光素酶基因，然后利用DNA重組技術(shù)將熒光素酶基因連接到表達(dá)載體pET28a中。經(jīng)過(guò)酶切和測(cè)序鑒定獲得重組熒光素酶的高效表達(dá)載體。然后采用低溫條件，經(jīng)lmmol的IPTG誘導(dǎo)后發(fā)酵出了具有高活性的熒光素酶，同時(shí)也對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化。其最佳誘導(dǎo)條件是：誘導(dǎo)溫度22℃，誘導(dǎo)時(shí)的菌密度即OD06，誘導(dǎo)時(shí)間l8小時(shí)，誘導(dǎo)劑IPTG濃度是lmmol／

3、L。在此基礎(chǔ)上，本研究嘗試了將發(fā)酵放大到了中試規(guī)模，然后收集濕蔭并利用超聲波進(jìn)行低溫破菌，離心并收集破菌上清。通過(guò)ATP快速檢測(cè)裝置檢測(cè)到了上清液中含有高活性的熒光素酶。利用離子交換層析和親和層析對(duì)熒光素酶進(jìn)行分離純化，最終49濕菌分離純化出了50ml熒光素酶，利用Braford法測(cè)得其濃度為2Smg／ml。上述方法和國(guó)內(nèi)外同行相比并沒有應(yīng)用包涵體復(fù)性的生產(chǎn)工藝，但是提高了熒光素酶的收率，而且還節(jié)約了生產(chǎn)成本。繼而，本論文對(duì)影響熒光素酶