廣西眼鏡蛇毒神經(jīng)生長因子的精制及其對HSC-T6細(xì)胞SAPK-JNK信號通路的影響.pdf

1、目的:為了獲取活性和純度更高的廣西眼鏡蛇毒神經(jīng)生長因子(NerveGrowth Factor,NGF)，對原有的分離純化方法進(jìn)行改良。并探索分離純化所得的NGF對大鼠肝星狀細(xì)胞(Hepatic Stellate Cell-T6，HSC-T6)應(yīng)激活化蛋白激酶/c-Jun氨基末端激酶(Stress Activated Protein Kinase/c-JunN-terminal Kinase，SAPK/JNK)信號通路中JNK表達(dá)量的影響

2、，進(jìn)而闡明NGF通過SAPK/JNK信號通路抑制肝星狀細(xì)胞增殖的機制。
　　方法:采用DEAE Sepharose CL-6B陰離子交換柱、Sephadex G-50凝膠層析柱和Macro-prep HighS強陽離子交換柱對廣西眼鏡蛇毒粗毒進(jìn)行純化。采用大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞（Rat Pheochromocytoma Cells，PC12），對每一步分離純化后所得各組分的NGF活性進(jìn)行檢測，并確定可使PC12細(xì)胞分化的最小NGF濃

3、度。采用CCK-8(Cholecystokinin-octo Peptide)法檢測NGF對HSC-T6細(xì)胞的增殖抑制作用。采用免疫印記(Westem Blot,WB)法檢測NGF作用HSC-T6細(xì)胞后，SAPK/JNK信號通路中JNK表達(dá)量隨時間（0min、5min、10min、30min、60min、120min和24h）的變化情況，以及加入抑制劑處理后SAPK/JNK信號通路中JNK的表達(dá)隨時間的變化情況。抑制劑處理的分組為空白組

4、、抑制劑組、NGF組和抑制劑+NGF組。
　　結(jié)果:通過DEAE Sepharose CL-6B陰離子交換柱、Sephadex G-50凝膠柱、Macro-prep HighS強陽離子交換柱分離純化廣西眼鏡蛇毒，得到的第二峰具有NGF活性，誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化的最小濃度為0.1μg/ml。其分子量約為23kDa，并且達(dá)到電泳純。該NGF對HSC-T6細(xì)胞具有增殖抑制作用，最佳抑制濃度為1μg/ml。以1μg/ml的NGF用于HSC

5、-T6細(xì)胞不同時間后，各時間節(jié)點的JNK的表達(dá)量沒有顯著差異，磷酸化的JNK的表達(dá)量隨作用時間的延長而減少。以10μmol/L的抑制劑和1μg/ml的NGF作用于HSC-T6細(xì)胞后，可以顯著的抑制磷酸化JNK的表達(dá)量。
　　結(jié)論:通過DEAE Sepharose CL-6B陰離子交換柱、Sephadex G-50凝膠柱、Macro-prep HighS強陽離子交換柱可分離純化得到高活性的NGF。NGF對SAPK/JNK信號通路中磷