聚氨酯形狀記憶過程中相分離微納結(jié)構(gòu)與回復(fù)應(yīng)變對(duì)細(xì)胞形態(tài)的調(diào)控研究.pdf

1、形狀記憶聚氨酯（SMPU）具有良好的生物相容性、力學(xué)性能和形狀記憶性能，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注。SMPU軟段與硬段因熱力學(xué)不相容而形成的相分離微納結(jié)構(gòu)是其具有形狀記憶效應(yīng)（SME）的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，而賦形、固定和形狀回復(fù)則是其體現(xiàn)SME的必需過程。賦形和回復(fù)這兩個(gè)動(dòng)態(tài)過程可改變相分離微納結(jié)構(gòu)；回復(fù)過程還可產(chǎn)生回復(fù)應(yīng)變。為了更深入地理解SME對(duì)SMPU生物相容性的影響機(jī)制，指導(dǎo)SMPU的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和加工，需深入認(rèn)識(shí)SMPU形狀記憶過程中相分離微納

2、結(jié)構(gòu)的變化及其與回復(fù)應(yīng)變對(duì)細(xì)胞行為的調(diào)控。但迄今為止，尚缺乏相關(guān)研究。本文采用廣角 X射線衍射（WAXD）、小角 X射線散射（SAXS）、傅里葉全反射紅外光譜（ATR-FTIR）、差示掃描量熱（DSC）、原子力顯微鏡（AFM）、掃描電鏡（SEM）等技術(shù)考察了拉伸賦形與形狀回復(fù)過程對(duì)SMPU薄膜相分離微納結(jié)構(gòu)的影響及影響機(jī)制，并以成骨細(xì)胞為模型細(xì)胞考察了微納結(jié)構(gòu)與回復(fù)應(yīng)變對(duì)細(xì)胞形態(tài)的調(diào)控作用。主要研究內(nèi)容和結(jié)論如下：
　　（1）拉伸

3、賦形對(duì)SMPU薄膜微納結(jié)構(gòu)的影響
　　本文采用軟段為聚乳酸-聚乙二醇三嵌段共聚物（PDLLA-PEG-PDLLA），硬段為六亞甲基二異氰酸酯（HDI）和哌嗪（PPZ）的嵌段SMPU作為模型材料，以聚(DL-乳酸)（PDLLA）為對(duì)照材料，采用溶液澆注法制備SMPU和PDLLA薄膜，考察拉伸賦形（拉伸率為0％，50%，100%，200%）對(duì)SMPU相分離微納結(jié)構(gòu)的影響，為深入理解賦形對(duì)細(xì)胞形態(tài)的調(diào)控及調(diào)控機(jī)理奠定基礎(chǔ)。
　?、?/p>

4、未賦形SMPU薄膜具有明顯的相分離結(jié)構(gòu)，硬段逐級(jí)聚集形成硬段微區(qū)、獨(dú)立“島”結(jié)構(gòu)和納米纖維，在軟段相中形成無序的硬段相化學(xué)“圖案”；而對(duì)照材料PDLLA薄膜表面均一、平滑，僅出現(xiàn)因微弱結(jié)晶而導(dǎo)致的相分離現(xiàn)象。
　?、诶熨x形使光滑的PDLLA表面出現(xiàn)了垂直于拉伸方向排列的納米突起。而在 SMPU表面，拉伸賦形導(dǎo)致硬段微區(qū)與“島”結(jié)構(gòu)的長軸垂直于拉伸方向并且沿拉伸方向聚集，最終導(dǎo)致納米纖維平行于拉伸方向，表明拉伸賦形可以改變SMPU

5、的表面微納結(jié)構(gòu)并提高納米纖維的有序性，提示對(duì)SMPU拉伸賦形可望成為一種制備有序化學(xué)“圖案”的新方法。
　　（2）拉伸賦形所致相分離微納結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞粘附與蛋白吸附的影響
　　分別以成骨細(xì)胞和纖連蛋白（Fn）為模型細(xì)胞和模型蛋白，采用免疫熒光染色技術(shù)考察拉伸誘導(dǎo)的微納結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞形態(tài)與蛋白吸附的影響。結(jié)果顯示：細(xì)胞長軸與Fn組裝的蛋白纖維在SMPU薄膜表面均平行于拉伸方向，而在PDLLA薄膜表面則均垂直于拉伸方向，表明拉伸誘導(dǎo)的表

6、面微納結(jié)構(gòu)可以調(diào)控細(xì)胞取向與蛋白組裝，提示賦形處理可影響SMPU材料-細(xì)胞相互作用。同時(shí)，該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，拉伸賦形可成為一種制備有序化學(xué)“圖案”以調(diào)控細(xì)胞行為的新方法。
　?。?）回復(fù)介質(zhì)對(duì)薄膜形狀回復(fù)與微納結(jié)構(gòu)的調(diào)控
　　回復(fù)過程是SMPU體現(xiàn)形狀變化的過程，在醫(yī)學(xué)應(yīng)用中通常是在體液環(huán)境中發(fā)生?？疾祗w液回復(fù)環(huán)境對(duì)SMPU相分離微納結(jié)構(gòu)和形狀回復(fù)的影響及其機(jī)制，可為全面、深入地理解SMPU生物相容性提供理論基礎(chǔ)，也可指導(dǎo)S

7、MPU醫(yī)學(xué)應(yīng)用方案的制定。因此，本研究將拉伸賦形SMPU薄膜兩端固定以保持應(yīng)變恒定，將其置于32℃空氣或細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM中靜置24h；隨后，去除薄膜兩端固定裝置并分別升高空氣或DMEM的溫度使薄膜自由回復(fù)。通過考察介質(zhì)環(huán)境對(duì)薄膜形狀回復(fù)和表面微納結(jié)構(gòu)的影響，探討體液環(huán)境影響 SMPU形狀記憶過程的相關(guān)機(jī)理。“受限”處理旨在使薄膜經(jīng)歷薄膜-細(xì)胞復(fù)合物在形狀回復(fù)之前的處理過程（詳見（4）），以便更準(zhǔn)確地理解材料回復(fù)對(duì)細(xì)胞行為的調(diào)控機(jī)制。<

8、br>　　①定量檢測(cè)了回復(fù)力和回復(fù)率的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)薄膜在前20 min回復(fù)較快，在2h內(nèi)方可完成回復(fù)?！笆芟蕖碧幚韺?duì)拉伸賦形薄膜的表面微納結(jié)構(gòu)無顯著影響，但會(huì)因?yàn)閼?yīng)力松弛而降低薄膜形狀回復(fù)力和回復(fù)率。薄膜在DMEM中的形狀回復(fù)力和回復(fù)率明顯低于空氣中，DSC分析表明其機(jī)制與水分子增塑SMPU鏈段而導(dǎo)致應(yīng)力松弛增強(qiáng)有關(guān)。上述結(jié)果表明，介質(zhì)環(huán)境對(duì)形狀回復(fù)性能有明顯影響。
　?、谠诳諝庵谢貜?fù)時(shí)，薄膜表面的硬段組裝未完全回復(fù)到無序狀態(tài)，

9、多數(shù)納米纖維與拉伸方向呈>40°夾角排列，這與應(yīng)力松弛導(dǎo)致的薄膜形狀未完全回復(fù)有關(guān)；而在DMEM中回復(fù)時(shí)，薄膜表面硬段聚集增強(qiáng)，出現(xiàn)明顯的纖維狀和點(diǎn)狀硬段微區(qū)，且納米纖維與拉伸方向間的夾角也多高于40°，這可能與水分子增塑引起的不完全回復(fù)以及水分子與軟段形成的氫鍵作用有關(guān)。上述結(jié)果表明，回復(fù)介質(zhì)明顯影響SMPU薄膜的表面微納結(jié)構(gòu)，這為后續(xù)深入理解回復(fù)過程對(duì)細(xì)胞行為的影響奠定了基礎(chǔ)。
　?。?）薄膜形狀回復(fù)應(yīng)變與微納結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞形態(tài)的

10、調(diào)控
　　回復(fù)應(yīng)變可能對(duì)細(xì)胞施加持續(xù)力學(xué)刺激。因此，考察回復(fù)應(yīng)變對(duì)細(xì)胞行為的調(diào)控作用，可為SMPU生物相容性的評(píng)價(jià)提供一條基于生物力學(xué)的新思路。為考察回復(fù)應(yīng)變和微納結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞形態(tài)的調(diào)控作用，本研究將成骨細(xì)胞接種于拉伸賦形SMPU薄膜表面，于32℃下培養(yǎng)24h后去除薄膜兩端固定裝置，并將薄膜-細(xì)胞復(fù)合物轉(zhuǎn)入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中讓薄膜自由回復(fù)。利用活細(xì)胞工作站追蹤細(xì)胞對(duì)薄膜形狀回復(fù)的響應(yīng)，并用免疫熒光染色技術(shù)觀察薄膜回復(fù)后成骨細(xì)胞形態(tài)隨

11、培養(yǎng)時(shí)間的變化，利用CCK-8技術(shù)初步考察薄膜形狀回復(fù)對(duì)成骨細(xì)胞后期（1-7d）增殖行為的影響。
　?、賁MPU薄膜回復(fù)的總應(yīng)變隨拉伸率增加而增大，拉伸率為50%、100%和200%時(shí)其回復(fù)總應(yīng)變（%）分別為17.55±3.34、27.87±2.93和34.80±2.60。
　　②活細(xì)胞工作站和免疫熒光染色結(jié)果顯示：在薄膜回復(fù)初期（≤4h），SMPU回復(fù)應(yīng)變使成骨細(xì)胞趨于垂直于拉伸方向排列，且細(xì)胞取向變化與拉伸率有關(guān)，表明S

12、MPU回復(fù)應(yīng)變作為一種力刺激可以調(diào)控成骨細(xì)胞形態(tài)。
　?、跾MPU薄膜形狀回復(fù)24h后，細(xì)胞取向與薄膜表面納米纖維取向一致，表明隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長，回復(fù)應(yīng)變對(duì)細(xì)胞取向的調(diào)控作用會(huì)逐漸被基底微納結(jié)構(gòu)所取代。
　　④CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，薄膜形狀回復(fù)后1-7天內(nèi)，回復(fù)薄膜表面的細(xì)胞數(shù)明顯高于未回復(fù)薄膜表面。該結(jié)果表明，回復(fù)應(yīng)變可以作為一種力學(xué)刺激調(diào)控細(xì)胞形態(tài)并促進(jìn)細(xì)胞增殖，SMPU可望用作一種新型的動(dòng)態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)基底。