Capn4干擾對人黑色素瘤細胞增殖和遷移的抑制作用及其機制研究.pdf

1、目的：黑色素瘤是惡性程度最高的惡性腫瘤之一，晚期黑色素瘤患者總生存期低，預后差。做為預后最差的皮膚惡性腫瘤，近年來，其在世界范圍內的其發(fā)病率和死亡率均持續(xù)上升。眾所周知，在原發(fā)灶切除后，黑色素瘤有很高的復發(fā)、轉移風險。且轉移性黑色素瘤對高劑量IFN-α2b、化療、放療、免疫治療以及新近發(fā)展起來的分子靶向治療等治療手段均表現(xiàn)出高抵抗性。對于那些沒有BRAF突變以及BRAF突變患者經BRAF抑制劑治療后進展的患者，幾乎沒有特別有效的治療手段

2、可以選擇。因此，深入研究黑色素瘤的轉移機制和尋找一種可能的治療手段顯得十分必要。目前，大量的研究結果支持鈣蛋白酶在腫瘤細胞的增殖、遷移、轉移中起作用。鈣蛋白酶是一類細胞內鈣依賴性半胱氨酸蛋白酶家族，它包括無處不在的μ-鈣蛋白和m-蛋白。μ-鈣蛋白和 m-鈣蛋白均形成異二聚體，二聚體分別包括被鈣蛋白酶1（Capn1）基因和鈣蛋白酶2基因（ Capn2）編碼的80 kDa的催化亞單位和被Capn4基因（CAPNS1，鈣蛋白酶小亞基1）編碼的

3、28 kDa調節(jié)亞單位。在過去的幾十年中，大量研究發(fā)現(xiàn)鈣蛋白酶的活性與多種生理過程及病理過程有關。這些生理過程包括細胞支架的重建、細胞信號、凋亡和細胞生存；病理過程包括腫瘤細胞的粘附、遷移和侵襲等過程。μ-鈣蛋白和m-鈣蛋白在骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、肝細胞癌、結直腸癌及乳腺癌等多種惡性腫瘤中異?；罨Ｗ鳛殁}蛋白酶亞單位之一的Capn4，其功能也包括了調節(jié)腫瘤細胞凋亡、遷移和侵襲等等。目前研究發(fā)現(xiàn)，Capn4與多種腫瘤的遷移、侵襲有關，如：下

4、調Capn4抑制了腦膠質瘤細胞的侵襲、遷移，降低了金屬蛋白酶2（MMP2）、波形蛋白（vimentin）和N-鈣蛋白（N-cadherin）的水平。Capn4的過表達與肝癌、肝內膽管癌（ICC）、腎透明細胞癌(ccRCC)、鼻咽癌(NPC)、非小細胞肺癌（NSCLC）的侵襲和轉移有關。Capn4被認為可能作為HCC、ICC、NPC的一種分子靶向治療手段。研究證實，多種通路在惡性腫瘤細胞的遷移和侵襲中起調節(jié)作用，這些通路包括Wnt/β-c

5、atenin（β-catenin）信號通路、EMT和NF-κB(p65)通路等。廣泛存在的β-catenin信號通路被稱為促進腫瘤進程的“致瘤”信號通路，它影響惡性腫瘤細胞粘附、生長和分化等細胞進程。研究發(fā)現(xiàn)，β-catenin在多種腫瘤細胞中核內是增高的。異常的Wnt/β-catenin信號通路被發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤的發(fā)生中起重要作用。EMT是惡性腫瘤轉移過程中最重要的事件之一，EMT通過改變腫瘤周圍的微環(huán)境以利于腫瘤細胞從原發(fā)部位向遠處轉

6、移。研究發(fā)現(xiàn)，鈣蛋白酶在EMT中亦發(fā)揮作用。在EMT過程中，E-鈣蛋白（E-cadherin）被下調，N-鈣蛋白（N-cadherin）和vimentin被上調。NF-κB在不同腫瘤模型中表現(xiàn)出促進腫瘤進展的功能。它在黑色素瘤細胞中也表現(xiàn)出高活性。有研究報道，在黑色素瘤腫瘤的發(fā)生進程中，NF-κB起調節(jié)作用。大量的研究證實，β-catenin信號通路、EMT通路和NF-κB（P65）信號通路之間存在“相互對話”，并且互相影響活性及功能。

7、如：體內外試驗發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌細胞中抑制β-catenin信號通路的活性，可以抑制癌細胞的生長和EMT進程。在結腸癌細胞和乳腺癌細胞中，β-catenin信號通路和NF-κB通路相互影響。體內外試驗發(fā)現(xiàn)，敲除Capn4抑制細胞遷移、侵襲。下調Capn4抑制腦膠質瘤細胞的遷移、侵襲，且降低了vimentin和 N-cadherin的表達水平。通過分析GEO：GSE3189基因芯片，發(fā)現(xiàn)Capn4在黑色素瘤組織中高表達。目前Capn4在黑色素

8、瘤中的作用機制尚不明確，本研究以β-catenin及EMT為靶向切入點，研究Capn4在惡性黑色素瘤細胞中的作用及機制，旨在發(fā)掘黑色素瘤細胞可能的遷移及侵襲機制、提供一種新的惡性黑色素瘤的分子靶向治療奠定實驗及理論基礎。
　　方法：⑴從重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院收集黑色素瘤組織120例，正常組織34例供免疫組化用。把黑色素瘤組織及正常組織用多聚甲醛固定，然后經過不同濃度的酒精梯度脫水，再用二甲苯透明，然后用石蠟包埋。然后讓其自然冷卻

9、、凝固，然后切片。經甲醛固定、脫水、烤片等處理。為了封閉抗原中的部分非特異性位點，我們在組織切片上滴加山羊血清工作液，再在每張切片上加1滴第一抗體（一抗 Capn4）。經相關處理后在每張組織切片上加1滴酶標抗兔的第二抗體（辣根過氧化物酶標記），在室溫下孵育30min。經孵育、洗滌后在組織切片上滴加 DAB工作液。在光學顯微鏡下觀察組織切片的顯色情況，當觀察到淡黃色時，就判斷為陽性表達，隨即終止顯色。再經沖洗、蘇木素染核、酒精梯度脫水等處

10、理。本部分實驗均由兩名病理科醫(yī)師獨立閱片以及記錄結果。組織切片中細胞核或細胞漿出現(xiàn)（棕）黃色顆粒即為Capn4目的蛋白的陽性表達。⑵將人黑色素瘤細胞株A375、SK-MEL-1、MV3、M14以及HaCaT細胞培養(yǎng)于相應的培養(yǎng)基中。待細胞生長到融合度約達80％時，用胰酶消化傳代，傳代后的細胞繼續(xù)培養(yǎng)。用細胞刮刮下貼壁生長的細胞并將細胞轉移到EP管中，棄去上清液，加入細胞裂解液。采用 BCA蛋白濃度測定試劑盒來檢測所提取的蛋白樣品濃度，以

11、細胞蛋白抽提裂解液為空白對照。吸光度值測定波長調整為562nm，依次測定各樣品的吸光度值，每份細胞標本均測定3個測定值，取這三個反應值的均值作為結果。聚丙稀酰胺凝膠電泳，以目的蛋白的大小為依據(jù)，切下所需的膠條。經過轉膜、封閉等處理，將已稀釋好的Capn4一抗均勻滴于蠟板上，過夜后再加入二抗（辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP））孵育。再滴加適量ECL顯影液于蠟板上。放入凝膠成像儀中顯影。內參蛋白的灰度值及目的蛋白的灰度

12、值均通過Quantity one軟件計算后得到。目的蛋白的相對表達量為：目的蛋白（Capn4）與內參蛋白（GAPDH）灰度值之比。⑶根據(jù)目的基因Capn4設計3個靶點（shRNA1、shRNA2、shRNA3）做為實驗組以及1個無干擾功能的靶點為做對照組（Control shRNA）。把單鏈的引物退火成雙鏈oligo序列（寡聚T核苷序列），連接入雙酶切線性化的RNA干擾載體。測序驗證正確的轉化子，進行高純度質粒抽提。將黑色素瘤細胞株A3

13、75培養(yǎng)于DMEM+10%FBS的培養(yǎng)基中，當細胞生長至融合度達80%左右時，加入胰酶消化傳代，傳代后的細胞繼續(xù)培養(yǎng)，為后續(xù)實驗做準備。將黑色素瘤細胞株A375分成四組實驗：1組為對照組（con，Control shRNA），3組為實驗組（shRNA1、shRNA2、shRNA3）。將構建的Capn4干擾載體分別轉染到細胞株中，轉染成功后提取蛋白，“蛋白提取、電泳及灰度分析”步驟同“1.2 WB檢測黑色素瘤細胞及HaCaT細胞中Capn

14、4的表達”中的步驟。取每份細胞株3次試驗的平均值做統(tǒng)計學分析。⑷實驗將A375/M14兩種細胞分別分成兩組：對照組 con(Control shRNA)及實驗組shRNA（shRNA1）。將A375細胞株及M14細胞株培養(yǎng)于相應的培養(yǎng)基中。取1.5×105個處于對數(shù)生長期的A375/M14細胞接種于六孔板內，當融合率達到60%左右時進行轉染。將DNA-Lipofectamine2000復合物添加到細胞中、轉染。用WB法檢測轉染成功細胞的

15、Capn4的表達。“一抗、二抗、蛋白提取、電泳及灰度分析”步驟同“1.2 WB檢測黑色素瘤細胞及HaCaT細胞中Capn4的表達”中的步驟。取每份細胞株3次試驗的平均值做統(tǒng)計學分析。⑸分別將A375細胞株、M14細胞株培養(yǎng)于相應的培養(yǎng)基中。將前期構建的Capn4干擾載體轉染到A375和M14細胞株中。含有干擾Capn4功能的 shRNA載體為 shRNA實驗組，含有無干擾功能的 Control shRNA載體為con對照組，共4組細胞。

16、轉染方法同“2.2細胞轉染”。在96孔板的每孔鋪90μl含細胞的細胞懸液，即每孔含2.0×103 cells。每孔中各加10μl的5mg/ml的MTT液孵育，在第1d、2d、3d、4d、5d的時間點連續(xù)檢測。在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上選擇450nm波長測定各孔光吸收值，即450nm波長測OD值（optical density，光密度），并記錄結果。取每份細胞標本3次試驗的平均值進行統(tǒng)計學分析。SPSS軟件根據(jù)平均值畫出A375及M13細胞的生長

17、曲線（以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線）。⑹細胞培養(yǎng)及轉染方法同前。將前期構建的Capn4干擾載體轉染到A375和M14細胞株中。含有干擾Capn4功能的shRNA載體為shRNA實驗組，含有無干擾功能的Control shRNA載體為con對照組。分別將A375/M14實驗組及對照組細胞配成1×106個細胞/ml的細胞懸液；在鋪有載玻片的24孔板中按每孔2×104個細胞進行接種，在孵箱中培養(yǎng)12h后用4%多聚甲醛固定等處

18、理，再將TUNEL染色液加入每孔中，避光條件下孵育1h。孵育結束的細胞一部分直接用于TUNEL熒光分析、一部分用于DAPI實驗。將用于DAPI實驗的細胞用PBS浸洗3次后加入DAPI染色液進行細胞核染色，染色10 min后洗滌。將TUNEL染色及DAPI染色的細胞分別用抗熒光淬滅封片液封片，染后在熒光顯微鏡下觀察，計數(shù)TUNEL陽性細胞，觀察DAPI染色細胞的形態(tài)。⑺細胞培養(yǎng)及轉染方法同前。將前期構建的Capn4干擾載體轉染到A375和

19、M14細胞株中。含有干擾Capn4功能的shRNA載體為shRNA實驗組，含有無干擾功能的Control shRNA載體為con對照組。一抗為cleaved-caspase3，其余實驗步驟，如：蛋白的提取、電泳、灰度分析等同前。目的蛋白的相對表達量為：目的蛋白（Claeved-Caspase-3）與內參蛋白（GAPDH）灰度值之比。取每種細胞株3次試驗的平均值做統(tǒng)計學分析。⑻遷移實驗：分別將A375細胞株、M14細胞株培養(yǎng)于相應的培養(yǎng)基

20、中。將前期構建的Capn4干擾載體轉染到 A375和M14細胞株中（shRNA實驗組），含有無干擾功能Control shRNA載體的細胞為（con）對照組。取3×105 cells加入到Transwell小室中，置于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)48h-96h后將上室內的培養(yǎng)基去掉，用棉棒將上室內的細胞去掉，用結晶紫染色液進行染色。染色后用顯微鏡拍照、計數(shù)。侵襲實驗：在“遷移實驗”步驟的“將細胞加入Transwell小室”前，加做

21、步驟：“用1：8稀釋的Matrigel液包被Transwell小室底部膜的上室面，使其聚合成凝膠”，其余步驟與“遷移實驗”相同。⑼A375細胞培養(yǎng)及Capn4干擾（shRNA轉染）方法同前。將出生滿五周的BALB/c雄裸鼠隨機分成2組（實驗組：shRNA組；對照組：con組），每組3只。每只BALB/c裸鼠左側腹部皮下注射5×106個細胞。從第十天開始檢測各組腫瘤體積，麻醉后游標卡尺測腫瘤體積，腫瘤體積（單位：mm3）=長×寬×寬/2。

22、每周記錄一次。觀察腫瘤體積。第四周后以頸椎脫臼致死法處死裸鼠取得腫瘤組織。⑽分別將A375細胞株、M14細胞株培養(yǎng)于相應的培養(yǎng)基中。將前期構建的Capn4干擾載體轉染到A375和M14細胞株中（shRNA轉染）實驗組，含有無干擾功能Control shRNA載體的細胞為（con）對照組。一抗為Capn4、β-catenin-T（總蛋白）、β-catenin-N（核蛋白）、E-cadherin、N-cadherin、vimentin，以G

23、APDH為內參、CDK4為β-catenin-N核內參。其余實驗步驟，如：蛋白的提取、電泳、灰度分析等同前。目的蛋白的相對表達量為：目的蛋白（ Capn4、β-catenin-T、E-cadherin、N-cadherin、vimentin）分別與內參蛋白（ GAPDH）灰度值之比；β-catenin-N與核內參蛋白（CDK4）灰度值之比，取每種細胞株3次試驗的平均值做統(tǒng)計學分析（采用t檢驗，均數(shù)+標準差（SD）。P<0.05：差異有統(tǒng)

24、計學意義）。
　　結果：①黑色素瘤組織免疫組化染色計分方法：A：陽性細胞計分（0-3分）， B：組織中陽性細胞百分率計分（0-3分）。M：黑色素瘤組織陽性計分（0-9分）。計算式：分數(shù)值（M）=A× B。M：0-4分為低表達，5-9分為高表達。黑色素瘤組織中Capn4高表達率約為66.67%(80/120)，而正常組織標本中Capn4高表達率約為20.59%(7/34)，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。②WB檢測發(fā)現(xiàn)A375、

25、M14、SK-MEL-1、MV3四種黑色素瘤細胞中Capn4的表達均高于正常細胞HaCaT中Capn4的表達。以Quantity one軟件分析灰度值，Capn4在各黑色素瘤細胞系中的表達均顯著高于在HaCaT細胞系中的表達，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。③采用WB法，以GAPDH為內參，和對照組相比，shRNA1、shRNA2、shRNA3三個靶點均起到較好的干擾Capn4的效果，具有顯著性差異（P﹤0.01）。其中shRNA1

26、靶點效果最好，用shRNA1靶點進行后續(xù)實驗。④采用WB法，以GAPDH為內參，和對照組相比，shRNA1可以顯著降低M375/M14細胞中Capn4的表達（P﹤0.05）。以SPSS軟件分析Quantity one軟件所得的灰度值，Capn4在shRNA干擾的A375/M14細胞中的表達均顯著低于對照組細胞（P<0.05）。shRNA1靶點干擾效果好且穩(wěn)定，可以作為后續(xù)實驗的干擾靶點。⑤實驗組的OD值低于對照組。與對照組相比，shRN

27、A干擾的A375及M14細胞均表現(xiàn)出低活性，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。⑥干擾Capn4的A375/M14細胞的TUNEL陽性細胞百分比高于對照組（P﹤0.01）；Capn4干擾細胞中TUNEL片段多于對照組，DAPI染色提示shRNA轉染細胞中細胞膜形態(tài)的變化多于對照組，TUNEL及DAPI原位融合支持上述結果。⑦采用WB法，以GAPDH為內參，Quantity one軟件分析灰度值。和對照組相比，實驗組的灰度值高于對照組。S

28、PSS軟件分析灰度值結果，和對照組相比，shRNA轉染（干擾Capn4）可以顯著增加M375/M14細胞中cleaved-caspase3蛋白的表達（P﹤0.01）。⑧Transwell小室實驗發(fā)現(xiàn)，在侵襲實驗及遷移實驗中，Capn4干擾（ShRNA-轉染）的A375/M14細胞，其侵襲及遷移數(shù)量均顯著低于對照組，每組細胞取3次實驗的平均值用于統(tǒng)計學分析，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。⑨和對照組相比，注射Capn4干擾細胞的實驗組B

29、ALB/c鼠，腫瘤生長速度明顯慢于對照組。取每組3只老鼠腫瘤體積的平均值，以t檢驗為統(tǒng)計學分析方法，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。⑩采用WB法，以GAPDH為內參，和對照組相比，Capn4干擾（shRNA組，即shRNA1轉染）可以顯著降低M375/M14細胞中Capn4的表達（P﹤0.05）。
　　結論：⑴Capn4在黑色素瘤組織及細胞中的表達顯著高于正常組織及HaCaT細胞，shRNA轉染的質?？梢愿蓴_（下調）Capn4