石斛合劑序貫法對糖尿病合并肝損傷肝纖維化的作用機制研究.pdf

1、目的：
　　采取高脂高糖飲食+STZ誘導(dǎo)法構(gòu)建糖尿病合并肝損傷(NAFLD、NASH、肝纖維化)的大鼠模型，探討石斛合劑序貫法(dendrobium mixture in order cycle method，DMOC)干預(yù)糖尿病合并肝損傷及肝纖維化的療效及其作用機制。
　　方法：
　　健康清潔級SD雄性大鼠五周齡（體重180±10g左右）40只，由臺灣樂斯科生物科技股份有限公司購買。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后實驗大鼠隨機分成4

2、組:①Con組(基本飼料，n=10)、②DMOC組(基本飼料+DMOC配方，n=10)、③DMF組(高脂高糖+STZ，n=10)、④DMF+DMOC組(高脂高糖+STZ+DMOC配方，n=10)，①②為控制組;③④為誘導(dǎo)組。各組實驗大鼠分別喂食相對應(yīng)飼料并提供逆滲透水飲用，喂養(yǎng)4周后③④誘導(dǎo)組以腹腔注射2次STZ（25mg/kg+m2，間隔72h），注射后第4天，用血糖測定儀測量血糖，篩選空腹血糖＞11.1mmol/L、糖化紅蛋白＞17

3、％為糖尿病造模成功大鼠。③④誘導(dǎo)組造模顯示該飲食處理后大鼠出現(xiàn)高血糖、高血脂、肝功能異?，F(xiàn)象，喂養(yǎng)至36周后③④誘導(dǎo)組活檢顯示有顯著肝纖維化傾向，第36-44周②④組進行DMOC中藥干預(yù)。每周稱重1次，根據(jù)體重調(diào)整灌胃藥量，分別喂養(yǎng)長達44周末進行取材。觀察每組動物的健康狀況、體重、臟器重量、血清學檢測FBG、TC、TG、AST、ALT、ROS、TNF-α、IL-6、TGF-β1等指標。HE和Masson三色染色法觀察肝損傷及肝纖維化變

4、化情況。IHC法檢測肝組織α-SMA、Fibrinogen、Ⅳ-Collagen變化情況。WB法檢測Smad2、Smad3、pSmad2、pSmad3、α-SMA、MMP1、MMP2、MMP9的蛋白表達變化情況。
　　結(jié)果：
　　1DMOC干預(yù)糖尿病合并肝損傷的動物模式
　　1.1大鼠一般情況觀察:控制組大鼠一般情況良好，進食正常，毛色有光澤，體重穩(wěn)步增加，大便呈顆粒狀。誘導(dǎo)組大鼠均有不同程度的進食減少，精神萎靡、嗜睡

5、，皮毛晦暗，體重增加，便溏。
　　1.2大鼠體重變化情況:DMOC干預(yù)前，與Con組比DMF組的體重顯著著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);DMOC干預(yù)后，DMOC+DMF組與DMF組比，體重顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結(jié)果顯示糖尿病會使體重增加，而DMOC有改善體重變化情況。
　　1.3大鼠肝組織重量變化情況:DMOC干預(yù)前，與Con組比DMF組的肝組織重量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);

6、DMOC干預(yù)后，DMOC+DMF組與DMF組比，肝組織重量顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。結(jié)果顯示糖尿病會使肝組織腫大，而DMOC有改善肝組織重量的作用。
　　1.4大鼠腹腔脂肪重量變化情況:DMOC干預(yù)前，與Con組比DMF組的腹腔脂肪重量均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);DMOC干預(yù)后，DMOC+DMF組與DMF組比，腹腔脂肪重量均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。結(jié)果顯示糖尿病會使腹腔脂肪堆

7、積，而DMOC有減少腹腔脂肪堆積的作用。
　　1.5大鼠空腹血糖變化情況:DMOC干預(yù)前，與Con組比DMF組的空腹血糖顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);DMOC干預(yù)后，DMOC+DMF組與DMF組比，空腹血糖顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。結(jié)果顯示DMOC可有效降低糖尿病大鼠的空腹血糖功能。
　　1.6大鼠血脂變化情況:DMOC干預(yù)前，與Con組比DMF組的總膽固醇、三酰甘油酯均顯著升高，差異有統(tǒng)計學

8、意義(P值均＜0.01);DMOC干預(yù)后，DMOC+DMF組與DMF組比，總膽固醇、三酰甘油酯均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05、P＜0.01)。結(jié)果顯示糖尿病罹病時間增長，血脂有上升的趨勢，而DMOC具有推遲糖尿病大鼠血中總膽固醇上升及降低三酰甘油酯的功效。
　　1.7大鼠肝功能變化情況:DMOC干預(yù)前，與Con組比DMF組的AST與ALT均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P值均＜0.01);DMOC干預(yù)后，與DMF組比，D

9、MF+DMOC組的AST顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）與ALT降低20％，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05）。結(jié)果顯示糖尿病會引起肝損傷，而DMOC能減緩糖尿病對肝臟的傷害。
　　1.8大鼠肝組織HE染色觀察肝損傷情況:DMOC可明顯改善肝細胞泡沫樣變、細胞腫脹、界線不清、肝竇狹窄、中央靜脈周圍伴匯管區(qū)少量淋巴細胞浸潤程度。
　　2DMOC干預(yù)糖尿病合并肝損傷尤其肝纖維化的作用機制
　　2.1大鼠血清自由基R

10、OS變化情況:DMOC干預(yù)前，與Con組比DMF組的自由基ROS顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);DMOC干預(yù)后，DMOC+DMF組與DMF組比的自由基ROS顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01）。結(jié)果顯示糖尿病會使肝組織自由基ROS增加，而DMOC干預(yù)后可明顯減少。
　　2.2大鼠血清炎性細胞因子TNF-α變化情況:DMOC干預(yù)前，與Con組比DMF組的TNF-α顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);DMOC

11、干預(yù)后，DMOC+DMF組與DMF組比的炎性細胞因子TNF-α顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。結(jié)果顯示糖尿病會使肝組織炎性細胞因子TNF-α表達增加，而DMOC干預(yù)后可明顯減少炎性細胞因子TNF-α的表達。
　　2.3大鼠血清炎性細胞因子IL-6變化情況:DMOC干預(yù)前，與Con組比DMF組的IL-6顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);DMOC干預(yù)后，DMOC+DMF組與DMF組比的炎性細胞因子IL-6顯著降低

12、，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01）。結(jié)果顯示糖尿病會使炎性細胞因子IL-6增加，而DMOC干預(yù)后可明顯改善炎性細胞因子IL-6的表達。
　　2.4大鼠血清纖維化因子TGF-β1變化情況:DMOC干預(yù)前，與Con組比DMF組的TGF-β1顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);DMOC干預(yù)后，DMOC+DMF組與DMF組比的TGF-β1顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01）。結(jié)果顯示糖尿病會使促纖維化因子TGF-β1增加，而

13、DMOC干預(yù)后可明顯減少促纖維化因子TGF-β1的表達。
　　2.5大鼠肝組織Masson三色染色法觀察膠原纖維變化情況:糖尿病會引起肝纖維化，而DMOC可抑制大鼠肝組織細胞壞死、炎性細胞浸潤與膠原纖維增生。
　　2.6大鼠肝組織IHC法觀察α-SMA、Fibrinogen、Ⅳ-Collagen變化情況:糖尿病會引起肝纖維化，而DMOC對于肝細胞受損誘導(dǎo)α-SMA、Fibrinogen、Ⅳ-Collagen的活化有明顯的抑制

14、效果。
　　2.7大鼠肝組織WB法觀察pSmad2/Smad2、pSmad3/Smad3、α-SMA的蛋白表達情況:DMOC干預(yù)前，與Con組比，DMF組的pSmad2/Smad2、pSmad3/Smad3、α-SMA/β-aetin相對密度增加，差異有統(tǒng)計學意義(P值均＜0.01);DMOC干預(yù)后，DMOC+DMF組與DMF組比pSmad2/Smad2、pSmad3/Smad3、α-SMA/β-actin相對密度減少，差異有統(tǒng)計

15、學意義（P值均＜0.01）。結(jié)果顯示糖尿病會引起肝纖維化，雖然Smad2、Smad3表達各組均無明顯差異，而DMOC對pSmad2、pSmad3、α-SMA的蛋白表達有明顯的抑制效果。
　　2.8大鼠肝組織WB法觀察MMP1、MMP2、MMP9蛋白表達變化情況:DMOC干預(yù)前，與Con組比DMF組的MMP1/β-actin、MMP2/β-actin、MMP9/β-actin相對密度表現(xiàn)減少，差異有統(tǒng)計學意義(P值均＜0.01);D

16、MOC干預(yù)后，DMOC+DMF組與DMF組比的MMP1/β-actin、MMP2/β-actin、MMP9/β-actin相對密度顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P值均＜0.01）。結(jié)果顯示糖尿病會引起肝纖維化，而DMOC可增加MMP1、MMP2、MMP9蛋白表達，促進膠原蛋白分解。
　　結(jié)論：
　　1高脂高糖飲食+STZ造模的糖尿病合并肝損傷大鼠，可損傷胰腺組織導(dǎo)致分泌胰島素的功能受損，最后誘發(fā)出高血糖癥，繼續(xù)觀察有顯著肝損傷

17、及肝纖維化。此模式與“西方飲食”習慣所造成的T2DM合并肝損傷及肝纖維化相接近。
　　2DMOC可改善糖尿病合并肝損傷模型伴有肝纖維化大鼠的體重、肝組織重量、腹腔脂肪重量、FBG、TC、TG、AST、ALT、ROS、TNF-α、IL-6、TGFβ1異常的情況。
　　3DMOC可改善糖尿病合并肝纖維化大鼠肝組織的泡沫樣變、細胞腫脹、界線不清、肝竇狹窄、中央靜脈周圍伴匯管區(qū)少量淋巴細胞浸潤程度，減少α-SMA、Fibrinoge